miR-3182调控结直肠癌细胞增殖、侵袭、迁移的作用机制研究

木尼拉·马哈德 哈斯也提·艾力 帕丽达·帕拉哈提

结直肠癌是一种发病率和病死率均较高的恶性肿瘤。近年来随着生物学技术的进步，结直肠癌患者的预后生存率得到一定的提高，但仍是导致人类死亡率的主要原因之一[1]。临床上大部分患者确诊时，已错过最佳治疗时间，导致预后较差[2]。分子靶向治疗具有较强的特异性以及较小的不良反应，因此成为提高结直肠癌患者预后的研究重点。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类含18～25个核苷酸的非编码RNA，可通过结合于特定基因3，端非翻译区(Untranslated region，3，UTR)，调节其转录或翻译过程，影响细胞的增殖、迁移和侵袭等生命过程，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。miR-3182是近年来新发现的一种 miRNA，其在结直肠癌组织中异常表达，但其对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响还未知[3,4]。为探究miR-3182在结直肠癌的发生、发展过程中的作用以及分子机制，本实验从细胞水平进行研究，探讨miR-3182对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及调控机制，以期为结直肠癌病理演进分子机制的进一步阐释提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验主要材料 结直肠癌细胞系(HCT116、SW480、SW620)购自北纳生物有限公司，DMEM培养基、胎牛血清、Trizol试剂购自美国Thermo公司，Lipofectamine 2000购自美国Life Technologies公司，反转录试剂盒、荧光定量PCR(Quantitative polymerase chain reaction,qPCR)购自南京凯基生物有限公司，噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)购自美国Bio Basic Inc公司；Transwell小室购自美国Corning公司，miR-3182 模拟物以及对照质粒购自上海吉凯生物有限公司。酶标仪购自美国Bio-BRAD公司，7500荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2 细胞的培养 结直肠癌多种细胞系(HCT116、SW480、SW620)采用含10%胎牛血清DMEM培养基进行培养，置于5%CO2、37℃培养箱孵育，倒置显微镜观察结直肠癌细胞系生长状态，每2～3天加入胰酶消化、传代。

1.3 细胞的转染 选取对数期SW620细胞，随机分为对照组、miR-NC组、miR-3182组。在Lipofectamine 2000说明书指示下，miR-NC组、miR-3182组分别将对照质粒和miR-3182组模拟物转染入SW620细胞中，置于5%CO2、37℃培养箱培养，对照组为正常培养的SW620细胞。

1.4 qPCR实验 采用Trizol试剂提取对照组、miR-NC组、miR-3182组SW620细胞中总RNA，加入反转录试剂合成cDNA。以GAPDH为参照，进行qPCR扩增，反应条件设置为95℃ 5 min，95℃ 15 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，40个循环，结果采用2-ΔΔCt法进行计算。其中，miR-3182引物以及GAPDH引物由上海生工合成。见表1。

表1 引物序列

1.5 MTT实验 收集对照组、miR-NC组、miR-3182组SW620细胞，将(1～3)×103个SW620细胞接种于96孔板，37℃分别培养24 h、48 h、72 h，每孔SW620细胞中加入无血清培养基200 μl以及MTT(5 mg/ml) 20 μl，37℃继续培养4h，每孔SW620细胞加入二甲基亚砜(Dimethyl sulphoxide,DMSO)150 μl，37℃孵育10 min，振荡15 min，酶标仪在570 nm测定吸光值，记为A值。

1.6 Transwell实验 收集对照组、miR-NC组、miR-3182组转染24 h的SW620细胞，加入无血清培养基重悬，Transwell小室膜中预先覆盖Matrigel基质胶稀释液(1∶5 DMEM培养基稀释)，而细胞迁移实验Transwell小室无需覆盖Matrigel基质胶。将200 μl含有2×105个SW620细胞浮液加入Transwell上室，另外将600 μl含10%胎牛血清培养基加入下室，37℃培养24 h；棉花轻轻擦拭Transwell上室，甲醛固定、染色各30 min，拍照、计数5个区域细胞，取平均值。

1.7 靶基因的预测和验证 采用在线数据库TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)预测miR-3182下游靶基因，选取与肿瘤生长相关的基因B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)作为研究对象。双荧光素酶报告基因验证miR-3182与Bcl-2的靶向关系，野生型(Bcl-2-wt)和突变型(Bcl-2-mut)Bcl-2的3，-UTR荧光素酶报告载体由上海吉凯生物有限公司构建，并分别与miR-3182 模拟物和对照质粒共转染，37℃培养48 h，收集SW620细胞，测定双荧光素酶的相对活性。

2 结果

2.1 miR-3182在结直肠癌细胞系中的表达量 与人正常结直肠黏膜细胞(FHC)相比，miR-3182在结直肠癌多种细胞系(HCT116、SW480、SW620)中表达量均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。其中在SW620细胞中的表达量相对较低。见表2。

表2 miR-3182在结直肠癌细胞系中的表达量

2.2 miR-3182模拟物对miR-3182表达量的影响 与对照组相比，转染对照质粒对SW620细胞中miR-3182表达量无显著影响，但miR-3182模拟物可显著增加SW620细胞中miR-3182表达量，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 miR-3182模拟物对miR-3182表达量的影响

2.3 上调miR-3182对SW620细胞增殖的影响 与对照组相比，转染对照质粒对SW620细胞增殖无显著影响，但miR-3182模拟物随着时间的增加显著抑制SW620细胞增殖，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 上调miR-3182对SW620细胞增殖的影响

2.4 上调miR-3182对细胞侵袭、迁移的影响 与对照组相比，转染对照质粒对SW620细胞迁移、侵袭无显著影响，但miR-3182模拟物显著抑制SW620细胞迁移、侵袭，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5，图1。

表5 上调miR-3182对SW620细胞侵袭、迁移的影响 个,

图1 上调miR-3182对SW620细胞迁移、侵袭的影响(×200)

2.5 miR-3182靶基因的预测 Bcl-2 3，UTR区域(4654-4661)部分碱基可特异性结合于miR-3182，表明Bcl-2可能是miR-3182的潜在靶基因。见图2。

图2 Targetscan预测miR-3182下游靶基因

2.6 miR-3182靶向调控Bcl-2 miR-3182模拟物与Bcl-2-wt共转染较miR-NC组与Bcl-2-wt共转染显著降低SW620细胞的荧光素酶活性，差异有统计学意义(P<0.05)；但miR-3182模拟物与Bcl-2-mut共转染与miR-NC组与Bcl-2-mut共转染对SW620细胞荧光素酶活性无明显变化。见表6。

表6 双荧光素酶报告实验

3 讨论

结直肠癌的病理演进过程是一个多阶段、多基因参与的复杂生物学过程。在结直肠癌的发生、发展过程中，多个原癌基因以及抑癌基因的表达量发生明显变化。早期研究证实，在结直肠癌组织生长、转移过程中，miRNA的表达量发生异常变化[5,6]。miRNA可靶向调节多种在肿瘤发生发展过程具有重要作用的基因，通过降解或者抑制其翻译，影响其表达量，从而参与肿瘤细胞增殖、侵袭等过程。本项研究发现，miR-3182参与结直肠癌进展，具有抑制结直肠癌细胞增殖、侵袭、迁移的能力。值得注意的是，其作用机制可能与靶向调控结直肠癌细胞中Bcl-2的表达紧密相关，为结直肠癌分子机制的深入研究提供了新的启示。

近年来研究发现，miR-3182在肿瘤的发生、发展过程中，表达量发生显著变化，并且调控细胞的增殖、凋亡等生物学特性[7-10]。miR-3182在不同类型的癌症中起着抑癌或致癌的功能[11-14]，例如，与匹配的癌旁组织或正常成骨细胞系相比，miR-3182在骨肉瘤组织或细胞系中的表达量显著下调，可通过调控基质金属蛋白酶-2的表达水平抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和肿瘤生长，进而产生抑制肿瘤的作用。在鼻咽癌的发生发展过程中，miR-3182表达量明显增加，有助于鼻咽癌细胞发生转移，可作为预后监测的潜在分子标记物[15]。在三阴性乳腺癌中，miR-3182的表达量降低，通过靶向调节mTOR和S6K1的表达量，影响肿瘤组织的生长。在本实验中通过qPCR检测发现，miR-3182在结直肠癌细胞系(HCT116、SW480、SW620)中的表达量降低，与梁高锋等[7,16]的报道一致，这也表明miR-3182参与结直肠癌病理演进过程。其中在结直肠癌SW620细胞中的表达量相对降低，因此将SW620细胞作为后续实验对象。此前已有资料显示，在结直肠癌中，梁高锋等[7]利用高通量测序检测到miR-3182表达量明显降低，但其具体的作用尚不十分清楚。为进一步探究miR-3182的具体作用，本研究将miR-3182模拟物转染入SW620细胞中，qPCR检测转染效果发现，miR-3182模拟物可显著上调SW620细胞中miR-3182的表达量，说明成功构建上调miR-3182的细胞；MTT和Transwell实验结果显示，上调miR-3182的表达量明显抑制SW620细胞增殖、侵袭、迁移，与前人报道[14]相符，提示miR-3182在结直肠癌病理演进过程中发挥抑癌基因的作用。

Bcl-2是一种常见的癌基因，在肿瘤细胞增殖过程中发挥促进作用，有效抑制细胞的凋亡[17]。研究表明，Bcl-2是细胞多种凋亡信号转导通路的共同枢纽，在细胞凋亡过程中发挥关键作用[18-20]。为进一步探究miR-3182调控结直肠癌细胞增殖、侵袭、迁移的分子机制，本实验通过在线数据库预测以及双荧光素酶报告基因验证发现，Bcl-2是miR-3182的下游靶基因，表明miR-3182可能通过靶向调控Bcl-2影响结直肠癌细胞增殖、侵袭、迁移。

综上所述，miR-3182在结直肠癌细胞系中表达量降低；上调miR-3182显著抑制SW620细胞增殖、迁移、侵袭，其作用机制可能是通过靶向影响Bcl-2表达量；但本实验仅在细胞水平探究miR-3182的作用以及潜在分子机制，未来会在多株细胞系以及动物实验中进一步研究miR-3182的具体作用，为结直肠癌的分子靶向治疗提供潜在标志物。