AMI患者血浆miR-221-3p、miR-208b-3p表达水平与心肌损伤标志物及左心功能的关系

宫柏琪 张琳 王娜 李强 曹甜甜

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是常见的心血管系统疾病，全球每年发病例数达700万，患者一年病死率约10%，是导致患者死亡的主要原因[1]。冠状动脉粥样硬化斑块破裂、血栓形成及血管痉挛等因素引起部分或完全冠状动脉阻塞是AMI的病理基础。肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)及肌钙蛋白(cTnI)等是临床上常用的诊断AMI标志物，但这些标志物在临床症状发生后的几个小时内水平不会明显变化，并且在心肌炎、心功能不全的患者中上述指标也会升高，影响AMI的早期诊断[2]。因此，有必要寻找新的AMI生物标志物。微小MicroRNA(miRNA，miR)是内源的长度为19～25 nt 非编码单链RNA，通过影响mRNA降解或翻译抑制，在转录后水平的调控基因表达。miR在生理和病理过程中起着至关重要的作用，参与细胞发育、分化、增殖、迁移和应激反应[3]。近年来研究发现，循环miR是新的心血管疾病的生物标志物，在AMI，充血心力衰竭，冠心病等多种疾病中异常表达[4]。心肌细胞中富含多种miRNA，如miR-1、miR-208b，miR-221-3p等，近年来研究发现，AMI患者血浆miR-208b，miR-221-3p均存在异常表达的现象，有助于反映AMI疾病发展的进程，因此，血浆miR-208b，miR-221-3p可能是潜在的诊断AMI的生物标志物[5,6]。本研究通过检测血浆miR-221-3p、miR-208b-3p水平，研究二者与其他心肌损伤标志物及左心室功能关系，探讨其临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1月到2019年1月接受治疗的AMI患者132例作为AMI组，其中男81例，女51例；年龄38～69岁，平均年龄(52.61±7.50)岁；ST段抬高型心肌梗死(STEMI)92例，非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)40例；采用全球急性冠状动脉事件注册(GRACE)风险评分系统对AMI组患者进行危险分层评分[8]，具体评分指标包括，KiIIip分级、收缩压、心率、年龄、血肌酐、心电图ST段下移、心肌酶升高及院前心脏停跳，GRACE评分>140为高危组，共49例，109≤GRACE评分<140为中危组，共47例，GRACE评分≤108为低危组，共36例。另选取同期在我院健康体检的人群48例作为对照组，其中男29例，女19例；年龄36～72岁，平均年龄(51.13±7.24)岁。既往均无胸痛胸闷等表现、心电图、胸片、血生化、心肌酶学等检查未见异常。本次研究经我院伦理委员会的批准。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①AMI诊断标准参考欧洲心脏病学会(ESC)/美国心脏病学会(ACC)联合制定的2018年第四版全球心肌梗死指南[7]，并结合患者心肌缺血症状、心电图、心肌酶谱及影像学检查等；②患者为初次发作；③患者对本次研究均知情同意，并签署知情同意书。

1.2.2 排除标准：①同时合并有恶性肿瘤、感染性疾病及自身免疫性疾病；②既往患有心肌炎、心肌梗死等心脏病病史；③合并有精神疾病，不能配合本研究。

1.3 血浆miR-221-3p、miR-208b-3p的检测 抽取2组清晨空腹静脉血约8 ml，2 500 r/min离心10 min，离心半径10 cm，去除血细胞后分装于1号管、2号管，取1号管采用实时荧光定量PCR法(qPCR)检测血浆miR-221-3p、miR-208b-3p的表达，采用 Trizol 法提取血浆中的总RNA，溶于DEPC水中后使用Narodrop测定RNA浓度及纯度，A260/A280=1.8～2.1为宜，将总RNA进行逆转录，得到cDNA，以cDNA为模板，对miR-221-3p、miR-208b-3p进行qPCR检测。引物序列均由上海生工公司合成，以U6为内参，上游引物序列：5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，下游引物序列:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，miR-221-3p上游引物:5’-CGGCTACATTGTCTGCCTG-3’，下游引物:5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’，miR-208b-3p上游引物:5’-CCGATAAGACGAACAA-3’，下游引物:5’-GAGCAGGCTGGAGAA-3’。实验步骤按照miScript SYBR Green PCR试剂盒说明书进行(购自德国Qiagen公司,Cat.No.218076)。反应条件：95℃ 10 min变性后，95℃ 10 s，75℃ 30 s，60℃ 10 s，40个循环。总反应体系10 μl，cDNA 4 μl、上下游引物各0.5 μl、SYBR-Green PCR Master mix 5 μl。采用2-ΔΔCt法计算血浆中miR-221-3p、miR-208b-3p的相对表达量。

1.4 心肌损伤标志物及左心功能指标的检测 取2号管进行检测，心肌损伤指标采用放射免疫沉淀法测定，检测指标包括：肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、CK-MB及内皮素1(endothelin 1，ET-1)，采用全自动生化分析仪(roche，cobasE601)检测总胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、三酰甘油(triglyceride，TG)的水平。左心功能指标采用彩色超声诊断仪(飞利浦IE33)测量，指标包括左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室舒张末期容积(left ventricular end diastolic volume，LVEDV)及左心室收缩末期容积(left ventricular end systolic volume，LVESV)，连续测3个心动周期，结果取平均值。

2 结果

2.1 2组一般临床资料比较 对照组与AMI组患者在性别比、年龄、体重指数(body mass index，BMI)、吸烟、高血压、高血脂间无明显差异(均P>0.05)，AMI组患者血浆cTnI、CK-MB、ET-1、LVEDV及LVESV明显较高，而LVEF明显较低(P<0.05)。见表1。

表1 2组一般资料比较

2.2 4组血浆miR-221-3p、miR-208b-3p比较 与对照组比较，AMI组患者的血浆miR-208b-3p、miR-221-3p表达明显较高(t=40.794、35.950,P=0.000)。与NSTEMI组比较，STEMI组患者血浆miR-208b-3p、miR-221-3p表达明显较高(t=4.216、11.282,P=0.000)。见表2。

表2 4组血浆miR-221-3p、miR-208b-3p比较

2.3 不同危险分层的AMI患者血浆miR-221-3p、miR-208b-3p的比较 采用GRCE评分系统对AMI组患者进行危险分层，结果各危险分层的AMI患者血浆miR-221-3p、miR-208b-3p表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。与中危及低危组比较，高危组患者血浆miR-208b-3p、miR-221-3p明显较高；与低危组相比，中危组患者血浆miR-208b-3p、miR-221-3p明显较高(P<0.05)。见表3。

表3 3组血浆miR-221-3p、miR-208b-3p表达比较

2.4 AMI组血浆miR-221-3p、miR-208b-3p表达与心肌损伤标志物及左心功能相关性 AMI组患者血浆miR-221-3p、miR-208b-3p与cTnI呈正相关，与LVEF呈负相关(P<0.05)，而与CK-MB、ET-1、LVEDV、LVESV无明显的相关性(P>0.05)。见表4。

表4 AMI患者血浆miR-221-3p、miR-208b-3p与心肌损伤及左心功能指标的相关性

3 讨论

AMI是临床常见的危急重症，是心血管病患者高病死率的主要原因之一，是我国重要的公共卫生问题[9]。早期诊断AMI并及时进行冠状动脉介入治疗，患者常可获得良好的预后及生活质量[10]。深入研究AMI的分子机制，筛选具有早期诊断价值的血浆标志物，具有重要临床意义。心肌细胞缺血、缺氧损伤后，心肌细胞内蛋白或分子释放入血，如cTnI、CK-MB及肌红蛋白等，但特异性均不高，例如其中特异性最好的肌钙蛋白可以在心力衰竭患者或慢性肾脏疾病患者中长期表达上调[11]。有研究发现，非编码RNA在基因转录、转录后及表观遗传等方面控制基因表达，参与机体生长、发育及衰老等生物学过程，与人类肿瘤、心血管疾病等具有密切关联[12]。近年来研究表明，AMI患者血浆某些miR表达水平显著上调，并有可能成为AMI新的生物标志物及治疗靶点，为临床的诊断及新型药物的研发提供有价值的信息[13]。

miR-221-3p基因位于Xp11.3，编码一个外显子。研究表明，miR-221-3p是心脏组织中表达丰度较高的miR，特别是高表达于人动脉粥样硬化血管的内皮细胞内膜中，是调控调控心血管疾病发生发展的关键miR之一[14]。本研究中，AMI组患者的血浆miR-221-3p表达明显高于对照组，并且STEMI患者水平明显高于NSTEMI患者，表明AMI患者血浆miR-221-3p表达上调，目前表达上调的机制尚不清楚，可能是心肌缺血缺氧，激活磷脂酰肌醇3激酶/AKT信号通路，促进miR-221-3p基因表达[15]。而NSTEMI患者血浆miR-221-3p水平较低的原因可能是不完全梗阻的血管存在部分血流灌注，心肌细胞损伤程度较轻，miR-221-3p释放入血减少，并且NSTEMI患者炎症系统激活不明显，各种炎性因子对心肌细胞的损伤也较轻。目前AMI患者常用的风险评估方法包括GRACE评分、Branunwald分层及TIMI风险评分等，其中GRACE危险评分是最为有效的预测AMI不良心血管事件的工具，能够预测住院期间及出院半年内死亡风险[16]。本研究中，不同危险分层的AMI患者血浆miR-221-3p水平具有显著差异，危险程度越高，miR-221-3p水平越高。表明miR-221-3p水平的升高可能加重冠脉病变的严重程度，增加患者出院短期出现心血管不良事件的发生概率。有研究报道，miR-221-3p表达上调能够促进下游靶基因如P27的表达，促进血管内皮细胞及平滑肌细胞增殖，加重血管狭窄病变的严重程度，增加不良心血管事件的发生风险[17]。本研究中，AMI患者血浆miR-221-3p表达与cTnI呈正相关(P<0.05)，与LVEF呈负相关(P<0.05)，表明血浆miR-221-3p水平有助于反映心肌损伤严重程度及左心功能状况，有可能成为新的辅助评估心肌损伤程度及左心功能的血浆指标。

miR-208b-3p由P-肌球蛋白重链基因内含子编码，在心肌细胞发育过程中调控肌球蛋白重链的产生。越来越多的证据表明，miR-208b-3p在心肌细胞发育、心肌肥厚、心肌细胞凋亡及心肌梗死等多种病理生理过程中发挥重要作用[18,19]。本研究中，AMI组患者的血浆miR-208b-3p表达明显上调，其原因可能是miR-208b-3p在心脏组织中显著富集，而在正常组织表达水平较低，在心肌细胞损伤时其能释放入血，导致循环中miR-208b-3p水平升高。此外，本研究中，不同危险分层的AMI患者血浆miR-208b-3p水平具有显著差异，危险程度越高，miR-208b-3p水平越高，表明miR-208b-3p能够加重冠脉病变的程度。其原因是在缺血缺氧的刺激下，miR-208b-3p能激活心肌细胞中形成信号级联反应，促进下游增殖相关基因的表达，导致冠脉狭窄程度加重[20]。Wang等[21]研究进一步表明，应用右旋美托咪啶能通过抑制miR-208b-3p的表达，降低Wnt信号通路的过度活化，则能减轻心肌缺血/再灌注损伤。此外，AMI患者血浆miR-208b-3p表达与cTnI呈正相关，与LVEF呈负相关，表明血浆miR-208b-3p水平与心肌损伤严重程度及左心功能指标具有良好的相关性，有可能成为新的评估心肌损伤程度及左心功能的血浆指标。

综上所述，AMI患者血浆miR-221-3p、miR-208b-3p水平升高，二者与GRACE评分、cTnI及LVEF有关，有望成为新的评估心肌损伤及左心功能的血浆标志物。但由于样本例数有限，二者具体作用机制及临床预后价值有待进一步深入研究。