不同溶剂提取霞日-森登中黄酮类化合物成分比较

杨 洋,史永惠,刘 博,郝继红,陈羽涵,丁 华*

(1. 鄂尔多斯市检验检测中心,内蒙古 鄂尔多斯 017010； 2. 鄂尔多斯市蒙医医院,内蒙古 鄂尔多斯 017010)

霞日-森登(文冠果或文冠木)为无患子科文冠果属植物,系落叶小乔木或灌木[1-2],茎枝、种仁均可入药[3]。中医理论认为文冠木味甘,微苦涩,凉、轻、动、燥,具有清热消肿止痛之功效；蒙医理论认为霞日-森登能燥“协日乌素”,具有抗炎活血的作用,能治疗风湿性关节炎、风湿内热、皮肤风湿病等。

已有研究表明可从霞日-森登各部位中提取出多种化合物,主要为黄酮类、甾类、恩醌类、甾体类、香豆素等[4]。霞日-森登中含有多种黄酮类成分,如没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素、杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素、二氢槲皮素等[5-6]。儿茶素是黄烷醇型黄酮化合物的一种,最早从儿茶中提取出来,故被命名为儿茶素。现代医学多使用儿茶素治疗小儿消化不良、腹泻、外用治疗溃疡、湿疹等疾病。表儿茶素是一种从天然植物提取出来的黄烷醇化合物,与儿茶素互为同分异构体。表儿茶素存在我国许多中药复方制剂中,可作为评价药品质量的重要指标。表没食子儿茶素是儿茶酚同系物之一,一般研究表没食子儿茶素酸酯,故表没食子儿茶素的记载较少。二氢槲皮素是二氢黄酮醇类化合物之一,同时还属于维生素p族,最早被日本学者Fukui用热水提取法从花旗松的树皮中提取出来[7]。

本研究以不同提取溶剂对霞日-森登进行浸提,以浸膏得率为评价指标,初步判定提取效率的高低,再用高效液相色谱质谱联用仪(HPLC-MS)测定各提取液浸膏的成分,比较黄酮类成分的差异,考察不同提取溶剂对黄酮类成分的影响,为后续试验奠定基础。

1 仪器、药材与试剂

HPLC-MS(美国安捷伦公司)、旋转蒸发器RE 52-86A(上海亚荣生化仪器厂)、电子天平AL204-IC(METTLER TOLEDO)、数控超声波清洗器 KQ-500DE型(昆山市超声仪器有限公司)、索氏提取器、电动真空泵、Thermo Heraevs Multifuge X3R高速冷冻离心机(上海创萌生物科技有限公司)、溶剂过滤器(天津市津腾实验设备有限公司)。

霞日-森登(鄂尔多斯市蒙医医院)、乙腈[色谱级)(阿拉丁试剂有限(上海)公司]、乙酸(分析纯)(国药集团化学试剂有限公司)、 蒸馏水(广州屈臣氏集团有限公司)、乙酸乙酯(分析纯,天津市福晨化学试剂厂)、表没食子儿茶素、表儿茶素、二氢槲皮素、儿茶素对照品(HPLC≥98%)购于上海源叶生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 不同溶剂提取浸膏的制备

将干燥的霞日-森登制成粗粉,准确称取50g粉末,用滤纸包好后放入索氏提取器中,分别加入水、乙醇、正丁醇和乙酸乙酯,加热回流2h后,用旋转蒸发仪蒸发回收溶剂减压浓缩后制成浸膏,计算浸膏率,封装好放入4℃冰箱保存备用。

2.2 成分鉴定2.2.1 色谱条件

以安捷伦Eclipse Plus C18(2.1mm × 100mm,3.5μm)为色谱柱,柱温20℃,流速0.3mL/min,流动相组成为A：B=乙腈-0.4%醋酸溶液,按表1进行梯度洗脱。

表1 梯度洗脱程序

2.2.2 质谱条件

电喷雾电离子源(ESI),源电压4.5KV,正离子检测,采取一级全扫描及二级全扫描方式,扫描范围50～500m/z。分别以1μg/mL的对照品溶液摸索儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素和二氢槲皮素的质谱条件,确定离子对、分解电压和碰撞能量(见表2)。

表2 对照品的质谱条件参数

2.2.3 对照品溶液的制备

分别精密称取儿茶素、表儿茶素、表没食子素、二氢槲皮素对照品适量,用水溶解稀释,制成质量浓度皆为1μg/mL的对照品溶液。

2.2.4 供试品溶液的制备

分别精密称取霞日-森登水提取浸膏、乙醇提取浸膏、乙酸乙酯提取浸膏、正丁醇提取浸膏适量,用水溶解并稀释,制成质量浓度皆为1μg/mL的供试品溶液。

2.2.5 测定

采用HPLC-MS法测定不同提取溶剂作用于霞日-森登得到的浸膏中的黄酮类成分。将浸膏配制为1μg/mL,利用峰面积归一化法计算其黄酮类各成分含量。

3 结果

3.1 浸膏提取率

如表3所示,水提取浸膏率最低,乙醇提取浸膏率最高。采用乙醇和乙酸乙酯作为提取溶剂时,霞日-森登提取浸膏得率明显高于正丁醇和水,后续试验以乙醇提取浸膏和乙酸乙酯提取浸膏进行成分鉴定。

表3 不同溶剂浸膏提取率

3.2 黄酮类成分鉴定

图1显示,乙醇提取浸膏中可分离出四种黄酮类成分：儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素和二氢槲皮素；图3显示,乙酸乙酯提取浸膏中可分离出三种黄酮类成分：二氢槲皮素、儿茶素和表儿茶素。如图2、4所示：乙醇提取浸膏中表没食子儿茶素、表儿茶素含量较高；乙酸乙酯提取浸膏中表儿茶素含量较高。表4结果表明乙酸乙酯能较好提取霞日-森登中的表儿茶素,而乙醇相对于乙酸乙酯能较好的提取霞日-森登中的表没食子儿茶素。提示不同的提取溶剂对霞日-森登浸膏中的黄酮组分影响显著。

图1 乙醇提取浸膏质谱图

图2 乙醇提取浸膏峰面积归一化法图

图3 乙酸乙酯提取浸膏质谱图

图4 乙酸乙酯提取浸膏峰面积归一化法图

表4 不同溶剂提取浸膏黄酮类成分的百分含量

4 讨论

霞日-森登中含有大量的黄酮类成分,黄酮类化合物是从天然产物中获得的具有较强抗风湿活性的物质,不同黄酮类化合物的抗风湿活性作用可能不同,所以有必要对黄酮类化合物进行进一步研究。以抗风湿活性作用成分为指标,以水、乙醇、正丁醇和乙酸乙酯为溶剂对霞日-森登进行提取获得浸膏,用HPLC-MS法检测浸膏的黄酮类成分,结果证明溶剂不同,得到的霞日-森登浸膏可分离出的黄酮类成分不同。霞日-森登的研究与应用还需要更多的数据支持,后期拟继续采用响应面法优化提取霞日-森登多种成分的条件,更加细致的研究其抗风湿有效成分,深入研究其药理药效,以期为促进霞日-森登的临床应用提供理论依据。