天麻中糖基转移酶基因GeGT1的克隆及原核表达分析

刘梦丽，余函纹，单婷玉，吴君贤，彭华胜, ，程铭恩，查良平*，桂双英,

1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230038

2.中国中医科学院 中药资源中心，道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700

3.安徽省中医药科学院药物制剂研究所，安徽 合肥 230012

4.现代药物制剂安徽省教育厅工程技术研究中心，安徽 合肥 230012

5.药物制剂技术与应用安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012

天麻始载于《神农本草经》列为上品，原名“赤箭”，因其茎似箭，端有花，远看如箭有羽而得名[1]。天麻为兰科植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥块茎，性甘、平，归肝经，具有息风止痉、平抑肝阳和祛风通络的功效[2]。天麻作为药食同源滋补保健类药材，包含酚类、有机酸类、多糖类等多种活性成分[3-4]，具有抗惊厥、镇静催眠、镇痛、保护神经细胞、改善记忆及延缓衰老等药理作用[5]。

糖基转移酶（glycosyltransferase，GTs）是一类高度分化的多基因家族酶，广泛存在于动物、植物和微生物中，GTs能催化糖基团从供体分子转移到特异性受体分子，形成各种糖苷化合物[6-8]。天麻中很多活性成分是以糖苷化的形式存在，包括天麻素、巴利森苷等主要活性成分，糖基化反应是由GTs介导的植物体内的一种重要的次生代谢反应，通过糖基化修饰，能改善天然药物的水溶性、稳定性和生物利用度等[9]。

近年来，已经从霍山石斛[10]、布渣叶[11]、穿心莲[12]、地黄[13]、长春花[14]、花楸[15]等药用植物中克隆出了GTs基因。本研究以天麻作为实验材料，利用反转录聚合酶链式扩增（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）技术克隆天麻糖基转移酶基因（glycosyltransferase，GeGT1）的cDNA全长序列，构建原核表达载体并转化至大肠杆菌进行表达，研究GeGT1不同器官表达模式，为后期研究GeGT1及其生物学功能奠定了理论基础。

1 材料与试剂

1.1 材料

供试天麻材料来源于安徽省六安市金寨县金山寨食（药）用菌种植专业合作社，经安徽中医药大学药学院彭华胜教授鉴定为兰科植物Gastrodia elataBl.。天麻进入花期后，收集天麻的块茎、茎和花，迅速放入液氮中，带回实验室后保存于-80 ℃冰箱。

1.2 试剂

RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、TB Green®Premix Ex Taq™购自于TaKaRa公司；高保真酶购自于NEB公司；切胶回收试剂盒、感受态细胞Trans1-T1、感受态细胞Transetta（DE3）购自于北京全式金生物技术有限公司。所需引物由上海生工生物有限公司合成。

2 方法

2.1 基因数据获取

GeGT1基因序列来源于天麻转录组数据（本实验室），经冗余序列去除、序列组装，功能注释后分类。其他物种的氨基酸序列均来自于GenBank数据库。

2.2 总RNA的提取和cDNA的合成

按照RNA prep Pure Plant Kit试剂盒操作说明提取天麻块茎总RNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性。ND2000（Denovix DS-11＋，S-03512）测定天麻总RNA的A260和A280值，选择A260/A280为1.8～2.0的总RNA反转录成cDNA。以RNA为模板，采用TaKaRa反转录试剂盒（PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）进行反转录，得到天麻的cDNA，合成产物保存于-20 ℃冰箱中。

2.3 GeGT1基因的克隆

根据天麻转录组数据库，用Primer Premier 5.0软件设计基因特异性引物。上游引物：GT1-F：5’-ATGGTAGCAGCGGCACAGAATCCAT-3’；下游引 物：GT1-R：5’-TTACAAAAAAAAGGTCCCC TTCCAT-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以天麻的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增采用Phusion High-Fidelity酶（NEB，M0501S），PCR体系为98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，需40个循环；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测、回收，然后使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit切胶回收试剂盒回收目的条带，并将扩增产物连接至克隆载体pUC-GW-Amp，转化至大肠杆菌中，挑菌并进行菌液PCR验证，挑选8个阳性克隆菌液送至苏州金唯智公司完成测序。

2.4 GeGT1基因的生物信息学分析

利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）在线工具BLAST对基因核苷酸序列和氨基酸序列进行相似性比对分析；ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找基因开放阅读框（open reading frame，ORF）；ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）预测GeGT1基因编码的蛋白理化性质；NPS（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）进行蛋白质二级结构分析；Swiss Model（http://swissmodel.expasy.org/），进行三维结构建模，结合PyMOL软件预测蛋白质的三级结构；CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/ cdd/wrpsb.cgi）进行蛋白质结构域分析；TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）进行蛋白序列的跨膜结构域分析；SinalP4.0Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行蛋白序列的信号肽预测分析。运用ClustalW软件与其他植物的氨基酸序列进行比对，用 MEGA 6.06软件构建邻接（neighbor-joining）系统进化树，bootstrap重复次数为1000次。

2.5 GeGT1基因的原核表达

对测序后的序列进行分析，设计含有接头序列的无缝拼接引物，上游引物：GeGT1-BamH I-F：5’-GACAGCAAATGGGTCGCGGAATGGTAGCAG CGGCACAGAATCCAT-3’；下游引物：GeGT1-BamH I-R：5’-CGACGGAGCTCGAATTCGGATTACAAAAAAAAGGTCCCCTTCCAT-3’。以重组质粒为模板，进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并进行切胶回收。用BamH I限制性内切酶将pET-28a进行单酶切，并进行切胶回收。目的基因片段与原核表达载体进行无缝拼接，转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，涂在卡那霉素抗性固体培养基上，挑取单菌落，菌液PCR验证并将8个阳性菌液送至公司测序。将测序阳性的重组质粒转化大肠杆菌Transetta（DE3）感受态细胞，于LB液体培养基中37 ℃ 200 r/min振荡培养，至A600值为0.6～0.8，加0.4 mmol/L IPTG于28 ℃诱导12 h，收集菌液，进行SDS-PAGE检测。

2.6 GeGT1基因的表达水平分析

运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的方法检测GeGT1基因在天麻块茎、茎、花的相对表达量。以天麻β-actin基因为内参基因，运用Primer Premier 5.0软件设计实时荧光定量引物。GeGT1基因qRT-PCR上游引物：GT1-RT-F：5’-TGTTGGCGTTAGATGTTTGGA-3’；下游引物：GT1-RT-R：5’-ACCACCCAAACAAACGGA-3’，β-actin基因实时荧光定量 PCR 上游引物：β-actin-1-F：5’-GGGGATGAAGCACAGTCCAA-3’；下游引物：β-actin-1-R：5’-GCCGTGGTTGTGAAGGAGTA-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。按照“2.2”项方法，提取天麻块茎、茎和花中的总RNA，反转录合成c DNA，稀释10倍备用。应用Mx3000P实时荧光定量PCR仪（安捷伦，美国）进行PCR扩增。反应体系为25 μL，包括TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）12.5 μL、ROX Reference Dye（50×）0.25 μL、ROX Reference Dye II（50×）0.25 μL、GT1-RT-F 1 μL、GT1-RT-R 1 μL、c DNA 2 μL、ddH2O 8 μL。PCR条件：95 ℃、30 s，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、15 s，40个循环。实验中重复3次，绘制熔解曲线，采用2-ΔΔCt法分析基因的相对表达量。

3 结果与分析

3.1 GeGT1基因克隆和序列分析

以天麻的cDNA为模板，通过RT-PCR进行目的基因扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带约为1503 bp（图1-A），与目的基因片段大小吻合。重组质粒pUC-GWAmp-GeGT1经MluI和AscI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测得目的基因条带，约为1503 bp（图1-B），利用DNAMAN软件结合ORF Finder在线软件对GeGT1基因cDNA序列进行分析，GeGT1基因开放阅读框（ORF）全长1 503 bp，编码500个氨基酸。通过Genebank中BLASTX功能，对GeGT1蛋白序列进行同源比对分析，比对结果显示，GeGT1基因与铁皮石斛Dendrobium catenatumKimura et Migo同源相似性为58.56%，与小兰屿蝴蝶兰Phalaenopsis equestris(Schauer)Rchb.同源相似性为55.48%，与深圳拟兰Apostasia shenzhenicaZ.J.Liu & L.J.Chen同源相似性为55.14%。比对结果表明所获基因属于GTs家族，将该基因命名为GeGT1，GenBank 注册号为MW015078。

图1 GeGT1 (A) 和pUC-GW-Amp-GeGT1 (B) 的基因克隆Fig.1 Cloning of GeGT1 (A) and pUC-GW-Amp-GeGT1 (B)

3.2 GeGT1蛋白理化性质分析

利用在线工具ExPASy对GeGT1基因编码蛋白进行理化性质分析，结果显示，GeGT1编码蛋白由500个氨基酸残基组成，蛋白理论等电点为5.51，相对分子质量为55 494.33，不稳定系数为40.12，脂肪指数为80.34，可初步判断GeGT1蛋白为稳定的酸性蛋白。

3.3 GeGT1蛋白二级和三级结构预测分析

利用NPS在线软件对GeGT1蛋白的二级结构进行预测分析。结果显示（图2-A），GeGT1蛋白二级结构元件中无规卷曲（random coil）所占的比例最高，包含245个氨基酸，占49%；α-螺旋包含141个氨基酸，占28.2%；延伸链包含114个氨基酸，占22.8%。

利用SWISS-MODEL Workspace在线软件对GeGT1蛋白进行同源建模，结合PyMOL软件预测得到GeGT1三维空间模型（图2-B）及GeGT1活性中心氨基酸序列（图2-C），通过ExPAsy structure assessment程序评测推导，GeGT1蛋白模型6lzx.1.B序列相似性42%，全球性模型质量估测（global model quality estimation，GMQE）值为0.68。

图2 GeGT1蛋白的二级结构和三级结构Fig.2 Secondary and tertiary structure of GeGT1

3.4 GeGT1蛋白结构功能域、跨膜结构域以及信号肽分析

利用NCBI的Conserved domains在线工具对GeGT1蛋白进行结构域分析（图3-A），GeGT1的17～418 aa具有UDP-GTs的保守结构域，结果表明GeGT1蛋白属于GTB型超家族。利用TMHMM2.0在线工具对GeGT1进行跨膜结构区域预测（图3-B），结果表明，GeGT1蛋白含有一个显著的跨膜螺旋区，460～482 aa位于跨膜结构域，1～459 aa位于膜外侧，483～500 aa位于膜内侧，说明GeGT1属于跨膜蛋白。利用SinalP4.0 Server预测分析GeGT1蛋白的信号肽（图3-C），结果显示存在信号肽的概率为0.17%，故推测GeGT1蛋白不存在信号肽，是非分泌蛋白。

图3 GeGT1的结构功能域与跨膜结构域Fig.3 Structural functional domains and transmembrane domains of GeGT1

3.5 GeGT1的氨基酸序列同源比对

利用DNAMAN软件对GeGT1氨基酸序列与其他植物基因进行氨基酸序列同源比对。将GeGT1序列与铁皮石斛糖基转移酶（DcSGT，XP_020677364.1）、深圳拟兰糖基转移酶（AsUGT，PKA65321.1）、番红花糖基转移酶（CsUGT，AIF79773.1）进行多序列比对分析（图4），结果显示，这4种植物的同源性为60.25%，其中GeGT1与DcSGT的同源性最高，为58.56%。

图4 天麻、铁皮石斛、深圳拟兰和番红花GTs氨基酸序列同源性比对Fig.4 Amino acid sequence homology alignment of Gastrodia elata Bl, Dendrobium catenatum, Apostasia shenzhenica and Crocus sativus L.glycosyltransferase

3.6 GeGT1的系统进化树分析

选取GenBank中记载的25种植物的GTs基因的氨基酸序列：用MEGA 6.0软件采用邻接法构建GTs氨基酸序列的系统进化树（图5）。结果显示，来源于不同物种GTs基因的蛋白被聚成双子叶植物、单子叶植物、裸子植物、藻类和菌类，其中GeGT1与铁皮石斛、深圳拟兰和小兰屿蝴蝶兰GTs序列位于同一分支点，表明亲缘关系高，进一步证实了兰科植物GTs基因的同源性。

图5 GeGT1与其他物种GTs氨基酸序列的系统进化树分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of GeGT1 and other species glycosyltransferase amino acid sequences

3.7 GeGT1基因的原核表达

将重组质粒pET-28a-GeGT1转入大肠杆菌Transetta（DE3）感受态细胞中，菌液PCR检测阳性菌株。以pET-28a转入Transetta（DE3）感受态细胞作为对照，在0.4 mmol/L IPTG、28 ℃诱导12 h条件下观察重组融合蛋白的表达。同时重组菌株表达后收集菌体并进行破碎裂解，上清液进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示（图6），经IPTG诱导后的pET-28a-GeGT1菌株和上清液在63 000处出现明显的目的蛋白条带。

图6 GeGT1蛋白原核表达分析Fig.6 Prokaryotic expression of GeGT1 protein

3.8 天麻不同器官的GeGT1基因表达差异分析

运用qRT-PCR检测了天麻块茎、茎、花的GeGT1基因表达差异（图7）。结果显示，GeGT1基因在天麻各个器官中均有表达，GeGT1基因在花中的表达水平最高，其次是块茎，在茎中的表达水平最低。

图7 天麻不同部位的GeGT1基因表达水平Fig.7 Gene expression levels of GeGT1 in different organ

4 讨论

天麻是我国名贵的中药材，以块茎入药，含有酚酸类、有机酸类、脂类、多糖类等多种成分，被誉为“治风之神药”，是一种药食同源的中草药[16]，目前已入选安徽十大皖药，被卫建委列入药食同源试点品种。现代药理研究表明，天麻具有镇静、抗惊厥、镇痛、祛风湿、明目增智及延缓衰老等功效[17]。天麻中很多活性成分是以糖苷化的形式存在，包括天麻素、巴利森苷等主要活性成分。因此对天麻糖苷类化合物代谢途径酶基因的研究有利于提高天麻药用植物资源的应用价值。GTs在天麻糖苷类化合物合成过程中，起着至关重要的作用，目前在其他植物上已有广泛的报道，然而，天麻中关于该基因的研究较少。本研究成功克隆了1条GeGT1，ORF全长1 503 bp，编码500个氨基酸，蛋白相对分子质量为55 494.33。通过生物信息学分析该蛋白具有UDP-GTs的保守结构域，属于GTB型超家族。构建了重组质粒pET-28a-GeGT1，在大肠杆菌中诱导出可溶性蛋白，为进一步研究GeGT1基因的体外功能奠定基础。

GTs是一个功能多样化的多成员基因家族，根据其氨基酸序列的相似性、底物特异性、反应机制、反应类型和三维结构，将GTs分为97个家族（GT1～GT97），其中GT1是含有GTs数量最多的家族[18]。GTs主要包括2种空间结构：GT-A和GT-B，GT1均采用GT-B折叠结构。在植物细胞中，GT1主要对小相对分子质量的大量生物活性天然产物进行糖基化。通过研究发现，GeGT1属于含有GT-B结构的GT1家族。GeGT1能够催化天麻素、巴利森苷等多种次生代谢产物的糖基化反应，并且其通常是生物合成中的最后一步。通过对天麻不同部位化学成分研究表明[19]，天麻素及17种氨基酸和总氨基酸含量大小顺序为花序＞茎＞根茎，与GeGT1在花和茎中的表达模式具有相似性。

在葡萄风信子中，葡萄糖基转移酶基因在根、鳞茎、叶、花中均有表达，在花中的表达量最高，在根、鳞茎和叶中微量表达[20]；在地黄中，地黄糖基转移酶基因主要在叶和根中表达，在茎中的表达量偏低[13]，这与本实验得到的GeGT1基因组织表达特异性结果一致。以上研究表明GeGT1蛋白在不同植物的不同器官中具有不同的表达模式。本研究中对GeGT1基因的克隆及生物信息学分析弥补了兰科药用植物天麻GeGT1基因的空缺，建立了原核表达体系，为其在分子水平上的进一步研究奠定物质基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突