葛根中1个新的6a,11a-脱氢紫檀素

杜 锟 ，田梦茹，盛丹阳，袁明昊，王琰琰，李梦园，支燕乐 ，马金莲，薛贵民 ，陈 辉 ，孙彦君 ，冯卫生

1.河南中医药大学药学院，河南 郑州 450046

2.河南中医药大学呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，河南 郑州 450046

3.河南中医药大学中医药科学院，河南 郑州 450046

野葛Pueraria lobata(Willd.) Ohwi系豆科（Leguminosae）葛属PuerariaDC.植物，主产于河南、湖南、浙江、四川等地，药用其根茎。葛根是我国的常用中药，被《中国药典》2015年版记载，其味甘、辛，性凉。归脾、胃、肺经，具有解肌退热、生津止渴、透疹、升阳止泻、通经活络、解酒毒的功效[1]。现代药理研究表明葛根在调血脂、抗氧化和抗抑郁活性等方面具有显著的药用价值[2-4]。目前报道的葛根化学成分主要有黄酮类、葛酚苷类、香豆素类、三萜及其皂苷类化合物[5]。其中，异黄酮类化合物为葛根的主要化学成分。为进一步丰富葛根化学成分的研究，完善其药效物质基础，本实验从葛根中分离得到11个化合物，分别鉴定为葛檀素（pueracarpanin，1）、芒柄花苷（ononin，2）、大豆苷（daidzin，3）、大豆素（daidzein，4）、4′,8-dimethoxy-7-O-β-D-glucopyranosylisoflavone，5）、异芒柄花苷（isoononin，6）、染料木素（genistein，7）、formononetin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-O-β-Dglucopyranoside（8）、7,2′,4′-trihydroxyisoflavone（9）、3′-methoxydaidzein（10）和芒柄花素（formononetin，11）。其中化合物1为1个新的6a,11a-脱氢紫檀素，化合物8和9为首次从葛属植物中分离得到。

1 仪器与材料

Bruker AVANCE III 500型核磁共振仪、Bruker maxis HD型飞行时间质谱（德国Bruker公司）；Autopol IV全自动旋光仪（美国鲁道夫公司）；Flexa型中压制备液相色谱仪（博纳艾杰尔公司，含FL-H050G型半制备型高压输液泵，HP-Q-UV100型紫外检测器，检测波长：210 nm和254 nm；Agela technologies型色谱工作站）。LC52型高压制备液相色谱仪（赛谱锐思北京科技有限公司，SP-5030型半制备型高压输液泵，UV200型紫外检测器，检测波长：210 nm和254 nm；Easychrom型色谱工作站；色谱柱为YMC-Pack ODS-A，250 mm×20 mm，5 μm）。薄层色谱硅胶GF254、柱色谱硅胶（200～300目，青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20（Pharmacia Biotech公司）；RP-C18（40～60 μm，YMC公司）；大孔树脂Diaion HP-20（日本三菱化学）；甲醇（色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司）；其他试剂均为分析级。

葛根于2018年5月购自郑州市药材市场，经河南中医药大学药学院董诚明教授鉴定为豆科葛属植物野葛P.lobata(Willd.) Ohwi的根茎。凭证样本（ID-20180520）存于河南中医药大学中药化学研究室。

2 提取与分离

葛根干燥根茎10 kg，醋酸乙酯和甲醇依次浸泡提取2次，滤过，合并提取液，减压浓缩，分别得到醋酸乙酯浸膏35 g和甲醇浸膏320 g。甲醇浸膏（100 g）经大孔吸附树脂Dianion柱色谱（70 cm×8 cm）分离，依次用水-乙醇（10∶0、8∶2、6∶4、4∶6、2∶8、0∶10）梯度洗脱，并经硅胶薄层色谱检识，合并相同流分得到6个组分（Fr.A～F）。Fr.C（25 g）经中低压RP-C18柱色谱（25 cm×5 cm）分离，依次用10%～100%甲醇（体积流量10 mL/min）梯度洗脱，得到9个亚流分（Fr.C-1～C-9）。Fr.C-9重结晶得到化合物3（505 mg）。Fr.E（32 g）经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化（甲醇），并经硅胶薄层色谱检识，合并相同流分得到9个组分（Fr.E-1～E-9）。Fr.E-2（5 g）经中低压RP-C18柱色谱（19 cm×3 cm）分离，依次用甲醇-水（10%→100%甲醇，体积流量10 mL/min）梯度洗脱，得到9个亚流分（Fr.E-2-1～E-2-9）。Fr.E-2-2（2 g）经硅胶柱色谱分离，依次用二氯甲烷-甲醇（25∶1、15∶1、10∶1）洗脱，得到组分10个亚流分（Fr.E-2-2-1～E-2-2-10）。Fr.E-2-2-6经制备型HPLC制备（65%甲醇，体积流量3 mL/min）得到化合物2（20.5 mg，tR＝11.5 min）、6（10.6 mg，tR＝12.5 min）。Fr.E-2-2-9经制备型HPLC制备（30%乙腈，体积流量3 mL/min）得到化合物8（5.5 mg，tR＝10.5 min）。Fr.E-2-3（700 mg）经硅胶柱色谱分离，依次用二氯甲烷-甲醇（25∶1、20∶1、15∶1、10∶1）梯度洗脱，得到8个组分（Fr.E-2-3-1～E-2-3-8）。Fr.E-2-3-8经制备型HPLC制备（25%乙腈，体积流量3 mL/min）分离得到化合物5（15.2 mg，tR＝23.0 min）。Fr.E-5（500 mg）经中低压RP-C18柱色谱（19 cm×3 cm）分离，依次用10%～100%甲醇（体积流量10 mL/min）梯度洗脱，得到16个亚流分（Fr.E-5-1～E-5-16）。Fr.E-5-3、Fr.E-5-7和Fr.E-5-10经制备型HPLC制备（溶剂分别为30%乙腈、80%甲醇、75%乙腈，体积流量3 mL/min）分别得到化合物9（4.5 mg，tR＝11.5 min）、4（10.3 mg，tR＝12.0 min）和1（2.5 mg，tR＝34.5 min）。Fr.E-7（1 g）经中低压RP-C18柱色谱（19 cm×3 cm）分离，依次用10%～100%甲醇（体积流量10 mL/min）梯度洗脱，得到18个亚流分（Fr.E-7-1～E-7-18）。Fr.E-7-8经硅胶柱色谱分离，依次用二氯甲烷-甲醇（25∶1、20∶1、15∶1、10∶1）洗脱，得到化合物7（6.5 mg）。葛根甲醇浸膏（100 g）加水混悬，用醋酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得醋酸乙酯部位（40 g）。醋酸乙酯部位（35 g）经硅胶柱色谱分离，依次用二氯甲烷-甲醇（30∶1、25∶1、15∶1、10∶1）洗脱，得到组分5个亚流分（Fr.1～5）。Fr.3（5 g）经中低压RP-C18柱色谱（19 cm×3 cm）分离，依次用10%～100%甲醇（体积流量10 mL/min）梯度洗脱，得到18个亚流分（Fr.3-1～3-18）。Fr.3-15重结晶得到化合物10（6.6 mg）。Fr.3-20经制备型HPLC制备（80%甲醇，体积流量3 mL/min）得到化合物11（10.5 mg，tR＝13.5 min）。

3 结构鉴定

图2 化合物1的结构Fig.2 Structure of compound 1

表1 化合物1的1H-NMR和13C-NMR波谱数据 (500/125 MHz, DMSO-d6)Table 1 1H-NMR and 13C-NMR data of compound 1(500/125 MHz, DMSO-d6)

图1 化合物1的关键1H-1H COSY和HMBC相关Fig.1 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

化合物1属于紫檀素类化合物，该类化合物具有抗菌、抗肿瘤等生物活性[7-8]，并且从天然产物中发现的较少，2012—2017年仅有32个新紫檀素类化合物被报道[8]。化合物1的发现进一步丰富了紫檀素类化合物的结构类型。

化合物2：白色无定形粉末，易溶于甲醇。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.43 (1H, s, H-2),8.05 (1H, d,J= 8.8 Hz, H-5), 7.53 (2H, d,J= 8.5 Hz,H-2′, 6′), 7.24 (1H, d,J= 1.4 Hz, H-8), 7.15 (1H, dd,J= 8.8, 1.4 Hz, H-6), 6.99 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3′,5′), 5.10 (1H, d,J= 7.1 Hz, H-1′′), 3.78 (3H, s,OCH3)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 174.7(C-4), 161.4 (C-7), 159.0 (C-4′), 157.0 (C-9), 153.6(C-2), 130.1 (C-2′, 6′), 126.9 (C-3), 124.0 (C-1′),123.4 (C-5), 118.4 (C-10), 115.6 (C-6), 113.6 (C-3′,5′), 103.4 (C-8), 100.0 (C-1′′), 77.2 (C-5′′), 76.4(C-3′′), 73.1 (C-2′′), 69.6 (C-4′′), 60.6 (C-6′′), 55.1(4′-OCH3)。以上数据与文献报道一致[9]，故鉴定化合物2为芒柄花苷。

化合物3：白色无定形粉末，易溶于甲醇。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.38 (1H, s, H-2),8.04 (1H, d,J= 8.8 Hz, H-5), 7.40 (2H, d,J= 8.4 Hz,H-2′, 6′), 7.23 (1H, d,J= 1.7 Hz, H-8), 7.14 (1H, dd,J= 8.8, 1.7 Hz, H-6), 6.81 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-3′,5′), 5.10 (1H, d,J= 7.1 Hz, H-1′′)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 174.7 (C-4), 161.4 (C-7), 157.2(C-4′), 157.0 (C-9), 153.3 (C-2), 130.0 (C-2′, 6′), 126.9(C-3), 123.7 (C-1′), 122.3 (C-5), 118.4 (C-10), 115.5(C-6), 114.9 (C-3′, 5′), 103.3 (C-8), 100.0 (C-1′), 77.2(C-5′′), 76.4 (C-3′), 73.1 (C-2′′), 69.6 (C-4′′), 60.6(C-6′′)。以上数据与文献报道一致[10]，故鉴定化合物3为大豆苷。

化合物4：白色无定形粉末，溶于甲醇。1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.27 (1H, s, H-2), 7.94 (1H,d,J= 8.8 Hz, H-5), 7.37 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-2′, 6′),6.91 (1H, dd,J= 8.8, 1.8 Hz, H-6), 6.83 (1H, d,J=1.8 Hz, H-8), 6.80 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3′, 5′)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 174.6 (C-4), 162.6(C-7), 157.4 (C-4′), 157.1 (C-9), 152.7 (C-2), 130.0(C-2′, 6′), 127.2 (C-3), 123.4 (C-1′), 122.5 (C-5),116.5 (C-10), 115.1 (C-6), 114.9 (C-3′, 5′), 102.0(C-8)。以上数据与文献报道一致[11]，故鉴定化合物4为大豆素。

化合物5：白色无定形粉末，易溶于甲醇。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.48 (1H, s, H-2),7.80 (1H, d,J= 9.0 Hz, H-5), 7.52 (2H, d,J= 8.7 Hz,H-2′, 6′), 7.36 (1H, d,J= 9.0 Hz, H-6), 7.00 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-3′, 5′), 5.10 (1H, overlapped d,J= 7.2 Hz, H-1′′), 3.94 (3H, s, 8-OCH3), 3.78 (3H, s,4′-OCH3), 3.18～3.74 (6H, m, Glc-H-2′′～6′′)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 174.8 (C-4), 159.0(C-4′′), 154.0 (C-7), 153.6 (C-2), 150.0 (C-9), 136.8(C-8), 130.0 (C-2′, 6′), 123.9 (C-1′), 123.0 (C-3),120.3 (C-5), 119.3 (C-10), 113.9 (C-6), 113.6 (C-3′,5′), 100.4 (C-1′′), 77.2 (C-5′′), 76.6 (C-3′′), 73.2(C-2′′), 69.5 (C-4′′), 61.2 (8-OCH3), 60.5 (C-6′′), 55.1(4′-OCH3)。以上数据与文献报道一致[12]，故鉴定化合物5为4′,8-dimethoxy-7-O-β-D-glucopyranosylisoflavone。

化合物6：白色无定形粉末，易溶于甲醇。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.43 (1H, s, H-2),8.03 (1H, d,J= 8.8 Hz, H-5), 7.51 (2H, d,J=8.5 Hz,H-2′, 6′), 7.16 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-8), 7.08 (1H,overlapped, H-6), 7.08 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3′, 5′),4.90 (1H, d,J= 7.3 Hz, H-1″), 3.90 (3H, s, 7-OCH3)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ: 174.7 (C-4), 163.8(C-7), 157.5 (C-9), 157.2 (C-4′), 153.7 (C-2), 130.0(C-2′, 6′), 127.0 (C-5), 125.3 (C-3), 123.4 (C-1′),117.6 (C-10), 116.0 (C-6), 114.9 (C-3′, 5′), 100.6(C-8), 100.4 (C-1″), 77.1 (C-5″), 76.6 (C-3″), 73.3(C-2″), 69.7 (C-4″), 60.7 (C-6″), 56.2 (7-OCH3)。以上数据与文献报道一致[13]，故鉴定化合物6为异芒柄花苷。

化合物7：淡黄色无定形粉末，溶于甲醇。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.94 (1H, s,5-OH), 8.30 (1H, s, H-2), 7.36 (2H, d,J= 8.5 Hz,H-2′, 6′), 6.81 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.36 (1H,d,J= 1.4 Hz, H-6), 6.20 (1H, d,J= 1.4 Hz, H-8)。13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 180.1 (C-4), 164.7(C-7), 161.9 (C-5), 157.6 (C-4′), 157.4 (C-9), 153.8(C-2), 130.1 (C-2′, 6′), 122.2 (C-3), 121.2 (C-1′),115.0 (C-3′, 5′), 104.3 (C-10), 99.0 (C-6), 93.7 (C-8)。以上数据与文献报道一致[14]，故鉴定化合物7为染料木素。

化合物8：白色无定形粉末，易溶于甲醇。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.39 (1H, s, H-2),8.07 (1H, d,J= 8.9 Hz, H-5), 7.53 (2H, d,J= 8.8 Hz,H-2′, 6′), 7.24 (1H, d,J= 1.9 Hz, H-8), 7.15 (1H, dd,J= 8.9, 1.9 Hz, H-6), 7.00 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-3′,5′), 5.04 (1H, d,J= 6.4 Hz, H-1″), 4.82 (1H, d,J= 2.8 Hz, H-1′′′), 3.79 (3H, s, 4′-OCH3), 4.47～5.51 (6H, m,glc, api-OH), 3.07～3.96 (m, glc, api-H)；13C-NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 174.6 (C-4), 161.3 (C-7),159.0 (C-4′), 157.0 (C-9), 153.6 (C-2), 130.0 (C-2′,6′), 127.0 (C-5), 124.0 (C-1′), 123.3 (C-3), 118.5(C-10), 115.4 (C-6), 113.6 (C-3′, 5′), 109.3 (C-1′′′),103.6 (C-8), 100.0 (C-1′′), 78.6 (C-3′′′), 76.4 (C-3′′),75.9 (C-2′′′), 75.6 (C-5′′), 73.2 (C-4′″), 73.0 (C-2″),69.9 (C-4″), 67.7 (C-6″), 63.1 (C-5″′), 55.1(4′-OCH3)。以上数据与文献报道一致[15]，故鉴定化合物8为formononetin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside。

化合物9：白色无定形粉末，溶于甲醇。1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.13 (1H, s, H-2), 7.92 (1H,d,J= 8.7 Hz, H-5), 6.97 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-6′),6.91 (1H, brd,J= 8.7 Hz, H-6), 6.83 (1H, brs, H-8),6.35 (1H, brs, H-3′), 6.26 (1H, brd,J= 8.2 Hz, H-5′)。13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 175.2 (C-4), 162.9(C-7), 158.3 (C-4′), 157.5 (C-9), 156.4 (C-2′), 154.2(C-2), 132.0 (C-6′), 127.1 (C-5), 121.7 (C-3), 116.3(C-10), 115.2 (C-6), 110.2 (C-1′), 106.3 (C-5′), 102.9(C-3′), 102.0 (C-8)。以上数据与文献报道一致[16]，故鉴定化合物9为7,2′,4′-trihydroxyisoflavone。

化合物10：白色无定形粉末，溶于甲醇。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.31 (1H, s, H-2),7.96 (1H, d,J= 8.7 Hz, H-5), 7.16 (1H, d,J= 1.8 Hz,H-2′), 6.98 (1H, dd,J= 8.2, 1.8 Hz, H-6′), 6.93 (1H,dd,J= 8.7, 2.1 Hz, H-6), 6.85 (1H, d,J= 2.1 Hz,H-8), 6.81 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-5′), 3.79 (3H, s,OCH3)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 174.8(C-4), 162.5 (C-7), 157.3 (C-9), 153.0 (C-2), 147.1(C-3′), 146.4 (C-4′), 127.3 (C-5), 123.5 (C-3), 123.0(C-1′), 121.5 (C-5′), 116.6 (C-10), 115.2 (C-6), 115.1(C-6′), 113.2 (C-2′), 102.1 (C-8), 55.6 (3′-OCH3)。以上数据与文献报道一致[17]，故鉴定化合物10为3′-methoxydaidzein。

化合物11：白色无定形粉末，溶于甲醇。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.33 (1H, s, H-2),7.96 (1H, d,J= 8.7 Hz, H-5), 7.50 (2H, d,J= 8.5 Hz,H-2′, 6′), 6.98 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.93 (1H,dd,J= 8.7, 2.0 Hz, H-6), 6.86 (1H, d,J= 2.0 Hz,H-8), 3.78 (3H, s, OCH3)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 174.5 (C-4), 162.6 (C-7), 158.9 (C-4′),157.4 (C-9), 153.1 (C-2), 130.0 (C-2′, 6′), 127.2 (C-5),124.2 (C-1′), 123.1 (C-3), 116.5 (C-10), 115.2 (C-6),113.5 (C-3′, 5′), 102.1 (C-8), 55.6 (4′-OCH3)。以上数据与文献报道一致[10]，故鉴定化合物11为芒柄花素。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突