欧拉型藏羊IL21基因序列、同源性及蛋白特性分析

陈晓慧，李 清，冶贵生*

(1.青海大学 农牧学院，青海 西宁，810016；2.青海大学 省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海 西宁，810016)

欧拉型藏羊主要分布在青藏高原，由于受到地理环境等因素的影响，欧拉型藏羊拥有较高的抗寒性与抗病性[1]。为了提高藏羊对疾病的抵抗力，发掘藏羊抗病免疫基因对其种质资源的开发具有重要意义。早在20世纪末，Parrish-Novak等[2]提出白细胞介素-21(IL21)。IL21主要是由滤泡辅助T 细胞(Tfh)、辅助性T细胞17(Th17)和自然杀伤细胞(NK)产生[3-4]，可增强CD+8 T细胞的扩增和CD+4 T细胞向效应T细胞的分化[5-6]。IL21受体(IL21Rα)可有助于B淋巴细胞、T淋巴细胞和NK细胞等细胞的增殖与分化，IL21与其受体IL21Rα连接可促进B细胞依赖性Ig G产生，从而增强细胞毒性和提高杀伤能力[7-8]。IL21作为一种多效性细胞因子，在先天性免疫和适应性免疫应答中发挥着重要作用，与多种自身免疫性疾病有关。IL21能抑制肿瘤的生长繁殖，通过促使合成IFN-γ在抗肿瘤中有着良好效果[9]。IL21最开始对Th1细胞进行诱导分化，使得机体细胞对病毒有一定的免疫效果，合成大量IFN-γ，这对NK细胞的增殖和CTL效应有着一定的推动作用；IL21还可以通过联合其他细胞因子活化STAT1和STAT3等信号通路[10]，不但对细胞的毒活性有所提升，更是可以良好的促进IFN-γ分泌，使得效应T细胞和NK细胞可以更好地工作，实现抑制肿瘤生长的效果[11-12]。另外，在HIV感染的患者中，IL21提高了CD+8 T细胞和NK细胞分泌穿孔素以此来抑制HAVD的复制[13]，控制HIV感染。由于IL21对HIV患者的T细胞、NK细胞和B细胞可以起到一个较好的改善效果，所以在对HIV患者的诊断与该病毒的研究途中，IL21可作为重要的生物标志物[14]。刘秀焕等[8]发现加强IL21的功能有利于癌症、HIV感染等疾病的治疗，但在一些免疫系统疾病如SLE和RA中，降低IL21的作用可提高临床疗效。目前关于藏羊IL21的研究未见报道，本研究使用PCR方法扩增了藏羊IL21基因，并进行了生物信息学分析，为欧拉型藏羊IL21免疫调控机理的研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 引物设计与合成

根据NCBI登录的绵羊IL21基因序列，使用oligo引物设计软件设计欧拉型藏羊IL21基因扩增引物，由TaKaRa公司(大连)合成。引物序列如下：IL21-F：5'-CACAAGTCAAGCTTCCAA-3'，IL21-R： 5'-GGACAGATGCTGATGAATC-3'，目的基因长度387 bp。

1.2 试验材料

试验样品欧拉型藏羊的脾脏组织采自青海省河南县屠宰场，由青藏高原动物疾病研究室采集、液氮速冻，-80 ℃冷冻保存。

1.3 试验试剂

RNA 提取试剂盒由 Aidlab Biotechnologies Co. Ltd提供；Prime Script 反转录试剂盒、预混液由 TaKaRa 公司(大连)提供。

1.4 提取总 RNA

取欧拉型藏羊的脾脏组织通过液氮研磨成末状，根据试剂盒说明书提取总 RNA。

1.5 反转录 cDNA

提取的欧拉型藏羊脾脏总 RNA通过反转录为 cDNA (操作依说明书)。

1.6 PCR 扩增

IL21基因的 PCR 合成体系：预混液 Premix Taq 25 μL、ddH2O 18 μL、模板 cDNA 5 μL、IL21 基因上、下游引物各1 μL。

反应条件：94 ℃ 1 min、50 ℃ 50 s、72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min 延伸，4 ℃ 保存。

1.7 IL21基因序列分析

将扩增产物送至测序公司进行测序，然后进行IL21基因核苷酸序列分析和同源性比对分析。

1.8 IL21 蛋白结构分析

使用 DNAStar、PredictProtein、I-Tasser 在线服务器对 IL21 蛋白结构进行预测分析。

2 结果与分析

2.1 IL21基因 PCR 扩增

经过凝胶电泳检测，应用IL21基因特异引物扩增出的产物大小约为 387 bp，与预期片段大小相符(如图1)，条带特异性强。

图1 IL21基因 PCR 扩增琼脂糖凝胶电泳M. DNA Marker;1.阴性对照;2. PCR产物Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of IL21 gene PCRM. DNA Marker;1. Negative control;2. PCR product

2.2 IL21基因核苷酸序列分析

序列分析结果表明(表1)，IL21基因片段长度为 387 bp，在碱基组成中腺嘌呤含量占 35.92%,且AT含量高于GC含量。

2.3 IL21基因同源性比对分析

本研究将欧拉型藏羊IL21基因与不同种类羊和不同种类牛的IL21基因核苷酸序列、氨基酸序列同源比对。用来做对比分析羊的种类包括山羊、绵羊和藏羚羊等；用来作对比分析牛的种类包括水牛、牦牛、瘤牛和美洲草原野牛等。结果表明欧拉型藏羊IL21基因与参考绵羊(登录号:NM_001256817.1)核苷酸序列同源性最高，为100%；与参考藏羚羊(登录号: XM_005971185.1)核苷酸序列同源性为99.5%；与参考山羊(登录号: XM_005691285.2)核苷酸序列同源性为99.0%，仅次于藏羚羊；与参考美洲草原野牛(登录号:XM_010860276.1)核苷酸序列同源性为98.4%；与参考牦牛(登录号: XM_005899735.1)核苷酸序列同源性为98.4%；与参考水牛(登录: XM_006078950.2)核苷酸序列同源性为98.2%；与参考瘤牛(登录号: XM_019977155.1)核苷酸序列同源性为98.2%。另外，氨基酸序列同源性依次为100%、100%、100%、98.4%、98.4%、98.4% 和97.7%，如图 2 和图 3 所示。

表1 IL21基因核苷酸序列分析Table 1 Nucleotide sequence analysis of IL21 gene

2.4 IL21蛋白结构分析

经分析发现，IL21 蛋白中 α 螺旋占 53.5%，其次是 β 转角占 27.1%，β 折叠最少，为 2.33%(图4)；亲水性分析结果显示，IL21 蛋白质的主要亲水区是1～13、26～35、37～50、57～71、77～99、101～115、121～129(如图5)；表面可及性分析表明，该蛋白在 1～8、24～28、39～43、61～70、77～94、102～116 位氨基酸呈现表面可及性较大(图6)；IL21 蛋白三级结构模型见图7。

图2 IL21基因核苷酸序列同源比对Fig. 2 The nucleotide sequence homology of IL21 gene

图3 IL21蛋白氨基酸序列同源比对Fig.3 The amino acid homology of IL21 protein

图4 IL21 蛋白二级结构Fig. 4 Secondary structure of IL21 protein

图5 IL21 蛋白亲水性Fig. 5 Hydrophilicty of IL21 protein

图6 IL21 蛋白表面可及性Fig. 6 Surface accessibility of IL21 protein

图7 IL21 蛋白三级结构模型Fig. 7 Tertiary structure model of IL21 protein

2.5 蛋白功能位点预测

通过对欧拉型藏羊IL21蛋白功能位点分析发现，该蛋白含有 1 个酰胺化位点，为88～91 位的AGRR；1个亮氨酸拉链模式，为11～33位LFIRLRQLIDIVDQLKNYVNDL。

3 讨 论

藏羊作为青藏高原的优良品种，具有抗病性强的种质特征，因此发掘欧拉型藏羊抗病免疫基因，对其种质资源的开发具有重要研究意义。IL21作为免疫机制辅助因子，在调控机体免疫应答机制中发挥重要作用，研究发现IL21可视为B细胞的免疫抑制因子，用于阻止免疫球蛋白合成[15]。IL21R是由人类幼稚B细胞、记忆B细胞和生发中心B(GCB)细胞以及浆细胞分泌[16-17]，分泌的IL21R又能反向调节B细胞的增殖分化及其功能，可提高B细胞等免疫细胞的免疫功能和活性[18]。IL21与IL21R的结合通过酪氨酸激酶-信号转导和转录激活因子(JAK-STAT)信号通路进行信号传导[19]。此通路经过激活JAK1与JAK3激酶的催化活化导致IL21R上的酪氨酸残基被磷酸化，从而为STAT蛋白和其他信号分子提供结合位点[20]。被磷酸化的STAT与同源二聚体或异二聚体发生二聚化后，转移到细胞核中并通过参与调节靶基因来调控B细胞[21-22]。目前，关于藏羊IL21基因方面研究报道很少，本研究使用PCR方法成功扩增出欧拉型藏羊IL21基因，对其进行了生物信息学分析，此研究结果可为藏羊IL21基因抗病功能研究提供参考依据。

本研究通过分析欧拉型藏羊IL21基因序列和同源性比对结果，发现欧拉型藏羊IL21基因与羊亚科类动物如绵羊、藏羚羊和山羊IL21基因的核苷酸序列同源性较高，均达到99.0% 以上，而与牛亚科动物如美洲草原野牛、牦牛、水牛和瘤牛IL21基因的核苷酸序列同源性低于羊亚科类动物，结果均在98.2%～98.4%之间，说明IL21基因具有一定的种属特异性，种族越相近，其同源性越高，并且两者相差仅有1%左右，说明IL21基因具有一定的保守性。胡春荣等[23]发现在小鼠和人类中表达螺旋A和D区时，IL21保守性很高。

蛋白质的卷曲螺旋具有多元化的作用，包括细胞骨架、寡聚化结构域及跨膜信号的调节等。由于肽链中的全部肽键都可形成氢键，因此蛋白质的α螺旋十分稳定，可牢固的维持蛋白的高级结构。β转角是较为松散的结构，稳定性低。本研究结果表明，在欧拉型藏羊IL21蛋白主要由α螺旋组成，占53.5%，表明 IL21蛋白稳定很好；且欧拉型藏羊IL21蛋白的77～115 区域亲水性指数高和蛋白表面可及性较大，这为研究藏羊IL21蛋白的免疫功能提供了理论依据。

蛋白质的翻译后修饰在生命活动中起着重要作用，可以让蛋白质的构成更丰富，使其功能具有多样性和完整性。经三级结构预测显示IL21蛋白含有酰胺化修饰位点和亮氨酸拉链区域。其中酰胺化修饰在蛋白质翻译中比较常见，是蛋白质翻译后修饰种类中的第4大类型，由于其发生于肽的C末端，所以也被叫做C-末端酰胺化。酰胺化修饰在动物神经系统和内分泌系统中普遍存在，超过一半的活性肽都存在此过程，在很多神经肽的生物活性中起着重要作用[24]。酰胺化不但可以作为生物活性肽与受体识别和信号转导过程中的重要因子，可能在提高多肽与受体亲和力方面具有显著作用，而且还与多种疾病如癌症和高血压等有关[25-26]。亮氨酸拉链 (BZIP) 蛋白是真核生物的转录因子和阻遏蛋白中最大且最保守的家族之一，在哺乳动物等真核生物中都发挥重要作用[27-28]，如在哺乳动物中具有抑制或者促进基因的翻译的作用。亮氨酸拉链越短其灵活可变性就越小，稳定性越高[29]；然而较长的拉链是为了能与特定配体结合，有着更好的二聚体特异性，但是稳定性较差。有些亮氨酸拉链的N端包含一些额外的DNA结合分子,这样可以增加DNA的稳定性[30]。蛋白质翻译后修饰对其蛋白的结构与功能具有重要意义，所有蛋白质都需要经过翻译后修饰，其结构更加复杂功能更加完整，才可表现出正常的生物学活性。

4 结 论

欧拉型藏羊IL21基因长度为387 bp(无终止密码子)，与参考绵羊、藏羚羊、山羊、美洲草原野牛、牦牛、水牛和瘤牛的IL21基因核苷酸序列同源性依次为100%、99.5%、99.0%、98.4%、98.4%、98.2%和98.2%；氨基酸序列同源性依次为100%、100%、100%、98.4%、98.4%、98.4% 和97.7%，藏羊与绵羊的亲缘性最高。IL21蛋白主要由α螺旋组成，是一种亲水性蛋白，含有酰胺化位点和亮氨酸拉链模式两种蛋白功能修饰位点。