青海省海晏县冷季草场枯草营养成分近红外漫反射光谱定量分析

于 璐,王 迅*,柴沙驼,刘书杰

(1.青海大学 农牧学院，青海 西宁 810016；2.青海大学 畜牧兽医科学院/青海省畜牧兽医科学院 青海省高原放牧家畜营养与生态国家重点实验室，青海 西宁 810016)

天然牧草营养含量分析，是计算草场合理载畜量及监测草畜平衡的基础，诊断草原健康状况的重要指标[1]，评价草业生产力高低的重要依据[2]。青藏高原地区受海拔高度、气候和放牧利用时间等影响，放牧草场包括暖季(夏秋)草场和冷季(冬春)草场两大部分，区别于其他地区，处于枯草期或枯黄期(11月-次年4月)的放牧家畜以枯草为主要采食对象，面对如此高利用率的冷季草场，如何计算冷季枯草生物量以及冷季草场营养状况，成为高原畜牧业发展的瓶颈。冷季草场地上枯草量下降的主要原因是放牧家畜的采食，同时也受到牲畜踩踏、气候及其它生物采食等影响，使得冷季草场长期处于过牧或严重过牧状态，导致冷季产草量的骤减，无法提供放牧牲畜正常生长发育所需的营养，造成放牧家畜“冬瘦、春亡”，牧户承担着巨大的经济损失；同时高原地区放牧家畜以反刍家畜为主，长期过牧对次年牧草的生长和发育产生负作用，降低草场利用率和自我恢复的能力，易扩大草场沙化的范围[3]。有研究表明[4-5]，以暖季测定的草场营养储量推算冷季草场各营养储量是有偏差的；同时温明章等[6]发现，返青期的羊草产量与冷季枯草产量有一定关系。由此可见，仅以暖季草场各营养指标含量推算冷季草场各营养指标含量是不准确的，如何高效获取冷季草场枯草各营养指标含量，成为探索高效放牧养殖、草原生态保护等研究的新方向。

近红外光谱分析技术(Near infrared reflectance spectroscopy, NIRS) ，是基于有机分子中与氢连接的化学键的吸收程度[7]，建立相关定标模型，实现对其化学成分的定量分析。Norris等[8]首次将NIRS技术引入对牧草水分、蛋白质、脂肪等的测定研究后，此技术便被大量试验于单种牧草、青贮饲料、粪便等营养成分的分析[9-12]。但枯草属非光合作用植被(Non-photosynthetic vegetation, NPV)，叶绿素含量极低，光谱吸收以木质素、叶黄素、叶红素和淀粉为主，对短波红外(Short-wave infrared,SWIR)较为敏感，其中SWIR-1和SWIR-2范围内散射占主导[13]，适用于枯草营养含量预测的NIRS模型鲜有研究。

本研究利用NIRS技术以及实验室测定数据，研究样品为高原地区冷季草场枯草，利用NIRS技术对枯草的光谱进行处理分析，建立枯草各营养含量的NIRS预测模型，满足对枯草期冷季草场营养含量信息的实际需求，进而开展枯草期草地营养状况、载畜能力、健康水平以及沙漠化监测等研究。旨在探讨NIRS定量分析枯草营养含量的可行性，建立干物质(Dry matter, DM)、粗蛋白(Crude protein, CP)、粗灰分(Crude ash, Ash)、粗脂肪(Ether extract, EE)、中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber, ADF)、木质素(Acid detergent lignin, ADL)、钙(Calcium, Ca)和磷(Phosphorus, P)含量的NIRS预测模型，实现快速、准确评估冷季枯草各营养成分含量，补充枯草期营养价值数据的空白，计算冷季草场最适营养载畜量，保证放牧家畜安全过冬过春。为高原畜牧部门放牧路线的安排、冷季草场区域的划分、入冬前售宰量的确定等提供参考，同时可作为草原沙漠化以及火灾监测、预警和评估的有效手段。

1 材料与方法

1.1 试验地概况与样品采集

海晏县位于青海环湖区域，100°23′～101°20′ E，36°44′～37°39′ N，海拔2 726～4 583 m，属高原亚干旱气候，可利用草场面积约为2416.67 km2，冷季草场1395.34 km2，畜均占有草场0.0065 km2[14]。其中冷季草场类型主要为高寒草甸类，植被种类包括紫花针茅(Stipapurpurea)、异针茅(StipaalienaKeng)、芨芨草(Achnatherumcaragana)、苔草(CarexLinn)、草地早熟禾(PoapratensisL)、高山嵩草(Kobresiapygmaea)、矮嵩草(Kobresiahumips)等[15]，所选样地植被覆盖度为57～95%。

野外实验于2017年11月-2018年4月12:00-14:00间开展，每月实施1次野外数据采集，选择无积雪天气，挑选地势平坦、植被类型单一的区域布设样方，采样点分布如图1所示，设置1.0 m×1.0 m样方共23处。运用齐地面刈割法进行样品采集，挑出石子、动物粪便、毒杂草等不可食部分，在采集地点直接称量，分别装入自封袋称重、贴标签，带回实验室内于65 ℃烘箱内烘干(48 h)至恒重后，称重记录干重，单位为g/m2，粉碎过1.0 mm筛，编号、密封、常温、避光保存用于NIRS分析和实验室测定。

图1 试验区样点分布情况Fig. 1 Distribution of sample points in the test area

1.2 试验方法

1.2.1 实验室化学成分测定 干物质(DM)：烘干称重法；粗灰分(Ash)：马福炉灼烧法；粗蛋白(CP)：半微量凯氏定氮法；粗脂肪(EE)：ANKOM XT15i型全自动脂肪分析仪测定；中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)和木质素(ADL)：ANKOM 200i半自动纤维分析仪测定；钙(Ca)：高锰酸钾容量法；磷(P)：酸溶、钒钼黄比色法[16]。每份样品进行2组平行试验，每组3次重复，取平均值代表各营养指标含量。

表1 试验区样点信息表Table 1 Information of samples in test area

1.2.2 近红外光谱扫描 选择FOSS公司的DS2500 近红外光谱分析仪进行样品光谱扫描，仪器技术参数如表2，在ISIscan软件中进行数据的处理与采集。按编号顺序依次取枯草样品放入圆形移动样品槽内，覆盖其容积的1/3即可，每次样品采集前均扫描背景，扫描次数设为16，计算机取均值后，输出log(I/R)形式的数据，储存为最终光谱。实验室测定时样品的状态、颗粒大小应与NIRS扫描时一致。为弱化装样产生的误差，每份样品装样重复3次，取其均值参与NIRS建模和分析[17]。

表2 DS2500技术参数详情Table 2 Details of DS2500 technical parameters

1.2.3 建立近红外模型的方法 定标软件选用WinISIⅢ，随机选择193份样品作为定标样品集，1/3作为验证样品集[18]，光谱预处理和数学计算进行散射校正后，利用主成分分析法进行筛选，结合修正偏最小二乘法(Modified partial least squares, MPLS) 和马氏距离 (Mahalanobis distance)[19]建立枯草各营养含量NIRS定标模型。按照Malley等[20]选择的定标指标，筛选出交叉验证标准误差(Standard error of cross validation, SECV)和定标标准误差(Standard error of calibration, SEC)趋于0、交叉验证决定系数(1 minus the variance ratio,1-VR)趋于1、交叉验证相对分析误差(Residual predictive deviation cross validation, RPDCV)较大的模型，为最优模型。利用验证样品集盲验最优模型的外部预测能力[21]，当 (1)>3、(2)>3时，验证通过；当(1)>2.5、(2)<3时，模型需要调整优化；当 (1)<2.5、(2) <2.5时，模型不可用[22]。

RPD=SD/SEP

(1)

RPDCV=SD/SECV

(2)

注：SEP.校验标准分析误差；SD.标准差；RPD.外部验证相对分析误差。

Note: SEP. Standard error of prediction；SD. Standard deviation；RPD. Residual predictive deviation.

2 结果与分析

2.1 枯草营养成分实验室测定

枯草营养成分测定结果如表3所示，DM、Ash、CP、EE、ADF、NDF、ADL、Ca和P含量分别为95.71%～98.36%、5.40%～6.44%、3.14%～6.93%、1.87%～3.66%、40.34%～45.45%、59.57%～66.33%、10.94%～24.37%、2.96%～6.12%和0.023%～0.047%。可见，枯草相比于天然牧草，具有较高的ADF、NDF和ADL，CP、Ca含量较低，P含量极微少，EE含量与天然牧草相近。

2.2 近红外扫描结果

全部样品NIRS光谱如图2，图中光谱存在多个吸收峰，吸收峰高低具有较好的区分度，因此，NIRS光谱可以作为枯草营养成分定量测定的依据[23]。由于枯草的纤维素和木质素含量高[24]，色素吸收光谱以叶红素和叶黄素为主，同时自由水的损失、细胞结构的变化，使得枯草光谱区别于绿色植被光谱，在红、蓝波段无吸收峰出现，而是在1 900～2 200 nm出现特征峰。

表3 枯草营养成分实验室化学分析结果Table 3 Laboratory chemical analysis results of hay nutrients

图2 枯草样品可见/近红外光谱图Fig. 2 Near infrared reflectance spectroscopy of the hay sample

2.3 最优定标模型及验证

在WinISIⅢ定标软件中，回归方法选择修正偏最小二乘法(MPLS)，结合不同光谱处理方法对定标样品集进行建模，筛选出枯草各营养指标最优NIRS定标模型，最优模型参数如表4。表中DM、CP、NDF和ADL的SECV分别为0.2735、0.5231、1.0945和2.3858，1-VR分别为0.9014、0.9847、0.9426和0.6142，RPDCV、RPD均大于3.；Ash、EE、ADF、Ca和P的SECV分别为0.9156、0.9459、1.6154、1.0316和0.0204 ，1-VR分别为0.9346、0.6165、0.9426、0.8931和0.8622，RPD分别为3.5439、1.3291、12.4669、2.3586和0.1711，RPDCV均小于2.5。以Park等[25]的评价方式为基准，DM、CP、NDF和ADL模型可以实现较高预测能力的近红外定量分析；Ash、EE、ADF、Ca和P模型无法进行近红外的定量分析。

3 讨 论

本研究主要利用NIRS技术，针对高原地区冷季草场枯草，共采集276份样品，构建枯草中DM、CP、Ash、EE、NDF、ADF、ADL、Ca和P的预测模型。其中DM、CP、NDF和ADL模型预测能力较好，DM模型测定能力最佳(1-VR=0.9014,RSQ=0.9512, RPDCV=6.8513)，何云等[26]在苜蓿青干草的定标模型研究中也曾论证DM模型的预测能力； NIRS技术主要测定N-H键等含氢基团[27]，与凯氏定氮法测定的为同价氮，本文CP模型具有较好的预测能力(1-VR=0.9847,RSQ=0.9362,RPDCV=5.1232)，这与惠明弟等[28]在玉米粗蛋白近红外预测模型研究中的结果相近；ADL和NDF模型的预测能力较好(1-VR=0.6142,RSQ=0.9121,RPDCV=3.9804和1-VR=0.9873,RSQ=0.9044,RPDCV=4.3673)，这可能与枯草中自由水含量低、木质素含量高等植物特性和细胞结构有关，与陈晓玲[29]建立羊草干草NDF的NIRS模型结果相近(RSQ为0.9594)。本文Ash、EE、ADF、Ca和P的NIRS模型欠佳(RPDCV、RPD<3，RSQ <0.7)，这可能由于Ca和P等微量元素中含氢基团较少，且枯草期主要贮存于植株根部，地上植株部分含量极微少，在近红外光谱波长范围内吸收较微弱，但Shenk等[30]在牧草P含量测定中，证明了NIRS技术的可行性，刘哲[31]得出天然牧草Ca与Ash的NIRS模型可以用于实际检测，因此日后还需大量实验研究NIR模型在枯草P、Ca、Ash含量预测中的适用性；可能由于叶绿素和脂溶性维生素等影响，NIRS技术预测枯草中EE含量偏差较大，与杜雪燕等[32]结论一致，NIRS技术能否用于预测枯草中EE含量有待考究。自从将NIRS技术引入天然牧草营养成分测定的研究后，构建了许多预测能力较好的定量分析模型[33-36]，高原地区特殊的气候与文化因素，使得进入枯草期后的冷季草场利用率提高，放牧家畜大多以枯草为食，由于枯草拥有不同于光合作用植株的光谱特征，而具有较好预测能力、普适性较高的枯草营养价值近红外模型还未曾出现。本文仅初步探究了针对高原地区冷季草场枯草营养成分的近红外模型，为快速进行枯草产量及冷季草场营养价值评价等研究提供新思路，为冷季载畜量计算、冷季过牧监测、冷季火灾监测以及草原生态评价提供基础数据。但不同地区植被类型、气候、土壤以及地理因素等影响，还需要更多草地研究学者的努力，对各地区冷季枯草进行采集与处理，完善各地区枯草营养成分近红外监测模型数据库，因地制宜的制定和指导冷季放牧。同时，枯草中镁(Mg)、铜(Cu)、锌(Zn)等其他矿物质元素含量能否利用NIRS技术进行预测，还需要更多学者研究分析。

表4 最优定标模型参数Table 4 Optimal calibration model parameters

4 结 论

研究以青海省海晏县为试验区，以冷季草场枯草为试验样品，讨论NIRS技术在枯草营养含量预测中的可行性，数学回归方法为修正偏最小二乘法，对比各种光谱处理方法，确定最优NIRS预测模型。枯草DM、CP、NDF和ADL的NIRS模型预测能力较好，可以快速评价高原地区冷季草场枯草的品质；Ash、EE、ADF、Ca和P的NIRS模型欠佳，仍需结合实验室测定优化模型，是否可以进行实际预测还需通过大量实验，验证其可行性。