生物传感器在农药残留快速测定中的应用

崔丽伟，胡 平，刘俊桃

(河南牧业经济学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 450046)

自上个世纪以来，农产品增产很大程度上获益于农药的推广应用。然而，即便是在极低浓度下农药残留也会对人体造成许多不利影响，因此对农药残留的检测意义重大。色谱技术以及色谱-质谱联用技术在农药残留检测中的应用十分普遍，且部分已有国家的标准，但该类方法存在需要专业人员操作、仪器昂贵、样品预处理过程复杂、测定耗时长、分析成本高等缺点，从而限制了这些技术的广泛应用[1]。近年来，随着电化学方法的不断发展，生物传感器随之产生。它具有灵敏度高、检出限小、易制备、测定成本低等优点，在物质痕量检测方面引起越来越多学者的注意。本文根据生物传感器的类型及检测原理，简要介绍生物传感器在农药残留中的应用。

1 生物传感器的定义、原理及分类

Clark于1956年首次提出生物传感器的概念，并在六年后成功地将葡萄糖氧化酶与氧电极结合测定了葡萄糖，间接验证了隔离式氧电极检测方法的可行性，酶电极由此产生。随着分子生物学与微电子学的持续发展，生物传感器的方法和理论也在不断发展变化[2]。国际理论和应用化学联合会将生物传感器定义为与转能器保持直接空间接触的生物识别元件(受体)提供特殊的定量和半定量分析信息的一个独立、完整的装置，测定原理如图1所示。待测样品扩散后与生物识别元件汇合，样品中的特定目标分析物会迅速和传感器的生物敏感层以酶与底物、抗原与抗体、核酸与其互补片段等方式进行特异性识别，出现声音、热量、颜色、质量等物理信号的变化，经特定仪表放大处理后被显示、记录。生物敏感元件显现的这些物理变化经不同的信号转换器(离子选择电极、压电装置、热敏电阻、光敏管等)转变成电信号，进行定量处理并经过二次放大处理后被输出，通过直接电极测定其电压或电流值，通过数据处理系统即可换算出被测样品中所含待测物物质的量和浓度。

图1 生物传感器的工作原理

除了在生物技术方面的应用，生物传感器在食品工业、发酵产业、环境监测及医药领域也有一定的应用。依据不同条件生物传感器可划分为不同类型。按生物传感器识别元件感受器敏感层不同，可分为酶传感器、免疫传感器、细胞传感器、组织传感器等；按生物传感器中信号转换器的检测原理不同，可分为酶电极生物传感器、光学生物传感器、压电生物传感器、声波道生物传感器、介体生物传感器、场效应管生物传感器、热敏生物传感器、光敏生物传感器等；按生物传感器中待测物质与生物敏感层作用类型不同，可分为亲和型生物传感器、代谢型生物传感器。在生物传感器的实际使用中，不同类型生物传感器的构成部件是通用的，各个类型之间存在着相互联系。常用于农药残留检测的生物传感器有：酶传感器、微生物传感器、免疫生物传感器和压电生物传感器等。

2 生物传感器在农药残留检测中的应用

2.1 酶传感器

在生物传感器的应用中，酶是首次被使用的分子识别元件，不同种类的酶制成的生物传感器在测定农药时的响应机理不同，例如，酪氨酸酶对酚类农药有催化作用，有机磷酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶有特异性抑制作用[3]。

乙酰胆碱是高等动物体内主要的神经递质，乙酰胆碱酯酶可迅速将乙酰胆碱水解生成醋酸盐和胆碱，从而实现神经系统的正常信号传输。Lu等[4]将制备好的钯@金纳米复合材料修饰电极表面负载的乙酰胆碱酯酶，构建了一种有机磷农药对氧磷的检测方法，该方法检出限为3.6 pM，线性范围是3.6 pM～100 nM。李纯等[5]采用静电纺丝法制备了氧化锌微纳米纤维材料修饰玻碳电极，然后在其表面负载酪氨酸酶，构建了Tyr/ZnO/CS/GCE生物传感电极来检测邻苯二酚的含量，该方法特异性好、灵敏度高且线性范围宽，为废水中邻苯二酚含量的检测提供新思路。

单一酶传感器仅能检测单一环境污染物，这已远远不能满足日益严峻的食品安全问题的需要。因此，人们开始在传感器上尝试多酶组合来增加可检测污染物的数量，例如可以通过固定酪氨酸酶和虫漆酶来检测各种酚醛树脂的残留物。

2.2 微生物传感器

近年来，分子生物学的发展为改变现有酶活性或在宿主细胞中表达外源蛋白提供了可能，使得微生物传感器有了更为广阔的应用空间[6]。

微生物传感器的基本检测原理如下：微生物利用物质进行呼吸代谢时会消耗溶液中的可溶性氧或制造电活性产物，可溶性氧的消耗量和电活性产物的总量反应被检测物质的量。通过气敏薄膜电极或离子选择性电极来检测可溶性氧和电活性产物的变化，从而得出所检测物质的总量[7]。例如，将小球藻固定到聚乙烯包被的碳电极表面，通过二极管照明在短时间内快速检测出除草剂中多种成分的含量。

微生物传感器将微生物紧密固定在传感器上，利用生物传感器反应时间短、操作稳定性好和能长期使用的特性，达到重复利用的目的。由于黄杆菌具有有机磷水解酶，可将甲基对硫磷水解为可检测的对硝基苯酚，从而为痕量检测甲基对硫磷提供了新思路。Kumar等[8]根据此原理，使用玻璃纤维滤纸将黄杆菌固定，开发了一种用于甲基对硫磷农药检测的光学微生物传感器，该方法操作简单、重现性好，所需样品量仅需75 μL，检出限低至0.3 μM。杨瑞红[9]综述了微生物传感器在有机磷残留检测中的应用，指出近年来为了构建监测有机磷残留的微生物传感器，不同类型的细胞被引入传感器的研究中，例如细胞表面表达有机磷水解酶(OPH)的E．Coli微生物传感器，细胞表面表达OPH的对硝基酚(PNP)降解细菌的微生物传感器，基于酿酒酵母的微生物传感器等。

2.3 免疫生物传感器

1990年免疫传感器的概念被首次提出，它具有灵敏度高、特异性强、操作简便及成本低廉等优点，被广泛应用于临床医学、生物学、食品工业、环境监测等多个不同领域。免疫传感器能够实现免疫诊断的定量化与操作的自动化，目前应用较为广泛。

免疫传感器[10]是利用抗体对抗原特异性识别和结合的特点，通过将抗体(或抗原)固化膜与信号转换器相结合实现对抗原(或抗体)的检测。当样品中的抗原选择性结合膜上固定抗体时，膜内离子载体的性质会发生显著改变，进而导致电极上电位发生变化，以此来检测待测抗体浓度。蒋雪松等[11]将毒死蜱人工抗原作为特异性识别原件固定在金电极表面，制备了特异性传感器，样品中的待测组分与电极表面的人工抗原竞争性结合溶液中的抗体，从而间接测定样品中毒死蜱含量。通过对传感器的灵敏度和准确度进行评价，发现所建方法检出限低、准确性和回收率高。

纳米材料因其生物相容性好、表面活性位点多、比表面积较大、吸附力强等特性，渐渐地进入电化学免疫传感器研究领域[12]。将纳米材料用在免疫传感器上，不仅可以提高电极表面生物分子的吸附量，还可以保持抗原和抗体的生物活性不降低，最重要的是能够加快响应界面电子传导或催化电极表面化学反应，因此两者结合可以用来研制高灵敏度、高选择性的免疫传感器。目前研制电化学免疫传感器的关键在于如何将生物分子有效地固定在电极表面而不改变其稳定性与活性。邹敏[13]合成了四叶草状的AuNP-Thi-MoS2纳米复合材料，用于修饰电极，然后在其表面负载待测抗体，采用方波伏安法、交流阻抗法对传感器制备过程进行表征，对传感器的准确度、灵敏度、选择性等进行评价，结果显示该免疫传感器能够较好地用于样品测定，采用MoS2-金属颗粒复合材料为基底的免疫传感器具有广阔的应用前景。

2.4 压电生物传感器

压电生物传感器是利用压电石英谐振器的传感特性监控原料发生反应后的共振器频率而检测原料是否发生改变，其优势为响应频带宽、灵敏度高、信噪比大、结构简单、工作可靠、重量轻等[14]。

压电生物传感器中最具代表性的是石英晶体压电传感器。石英晶体压电方法的核心是将目标受体固定在石英晶体的电极表面，在与配体结合时测量该目标受体在电极表面反应的信号转化，然后检测由晶体表面变化造成的晶体频率改变。

蒋雪松等[15]构建了一种基于流动注射的有机磷农药压电免疫生物传感器，比较了不同有机磷单克隆抗体在石英晶体金电极表面上的固定方式对待测信号产生的影响，建立了有效捕获有机磷农药抗原的方法。结果表明，当有机磷浓度在0.005～10 μg/mL范围时与晶体频率变化呈较好的相关性，所建方法最低检出限为2.16×10-3μg/mL。

除此之外，其他种类的生物传感器，例如以人工模拟生物分子为基础的生物传感器、全细胞生物传感器、光纤生物传感器等也已经被开发。

3 小结

近年来，随着分子生物学、计算机科学、食品科学的发展，生物传感器在其检出限、重复性、适用范围、灵敏度方面得到了较大改善，但是仍然存在一系列问题，例如特异性、稳定性需要进一步提高，制备过程需要简化等。随着科学技术的发展，生物传感器必将向多组分同时测定、微型化、智能化的方向发展，以适应社会发展的需求。