藏香猪血液中抗氧化肽的提取

张 震，杨朋坤，郑 鸣，王永芬

(1.河南牧业经济学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 450046； 2.河南牧业经济学院 动物科技学院，河南 郑州 450046； 3.河南省畜禽生物技术产业化工程技术研究中心，河南 郑州 450046)

藏香猪是我国青藏高原的一种独特的本土猪种，生长在平均海拔超过3000米的恶劣自然环境中。藏香猪具有耐粗饲料、抗病、肉质性能优良等特点，尤其具有较强的高原气候适应性。对藏香猪血液的生理生化分析显示，其血液具有比长白猪更强的低氧适应能力、抗氧化应激能力以及高的肌肉活动量，这与其生长环境密切相关[1]。因此，从藏香猪血液中提取高活性的天然抗氧化肽对提升藏香猪的综合利用价值具有重要意义。

生物体进化出了与其生长环境高度匹配的内源性抗氧化防御系统，正常需氧生物体内的活性氧(如羟基自由基、单线态氧、超氧阴离子和过氧化氢)均可通过酶促(谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氬酶和超氧化物歧化酶)反应和非酶促(谷胱甘肽、生育酚、抗氧化剂)反应被有效中和[2,3]。在病理或极端环境条件下，细胞的天然抗氧化防御能力易被破坏，经常产生过量的活性氧自由基(Realtive Oxygen Species,ROS)，导致细胞关键生物聚合物(蛋白质、脂质和核酸)的氧化损伤。这些生物大分子的持续氧化损伤与癌症、心血管疾病、阿尔茨海默氏症等慢性疾病的发生有密切关系[4，5]。藏香猪作为长期在高原低氧环境中生存的生物，其体内的抗氧化系统也相应地与低氧环境相适应，可以较强清除过量的ROS，保证物种的正常生存和繁衍[6]。

现有的抗氧化肽一部分是天然存在的，如鹅肌肽和谷胱甘肽等，但绝大多数是通过蛋白质的酶解、发酵、模拟胃肠道消化、食品加工或化学合成获得的[5]。食品源的多肽在胃肠道消化后产生的新肽可以使其抗氧化活性增加[7]。食品蛋白酶水解产生的抗氧化肽通常是高效、安全和廉价的。温度、酸碱度、压力、反应时间等水解条件以及酶底物比和水解度等因素都会影响食品蛋白酶衍生肽的化学性质。近年来，已经从红藻掌状藻[8]、加工鱼洗涤水[9]、鸡血细胞[10]、鱿鱼壳聚糖、鲍鱼内脏、牡蛎珍珠、米糠[11]、桑叶和桑蚕等多种不可食用或非传统食物中通过酶水解等方法获取抗氧化肽[5]。藏香猪富含独特抗氧化性能材料，目前只有少量文献报道其抗氧化肽的提取方法。

本研究以高原生存的藏香猪血液为原料，通过对复合酶种类、配比、酶解时间等因素进行研究，建立了一种超声波辅助酶解联合凝胶层析法从藏香猪血液中高效提取抗氧化肽，为藏香猪血液的综合利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

藏香猪血液由西藏农牧科学院提供，长白猪血液由中牟县猪场提供。胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K和DHHP清除检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，血液蛋白快速提取试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司，其他常用化学试剂购自国药集团，均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 猪血总蛋白的提取

取藏香猪抗凝血，利用血液蛋白快速提取试剂盒提取总蛋白，考马斯亮蓝法检测蛋白质浓度。

1.2.2 猪血总蛋白的酶解

100 mL总蛋白中分别添加50 U胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K或复合酶，37 ℃ 孵育12 h，每隔1 h取样一次，使用邻苯二甲醛法检测总蛋白的水解度。

1.2.3 超声波辅助总蛋白的酶解

酶解反应时，对酶解产物同时进行超声波处理，在超声波功率0～900 W，超声波频率0～35 Hz，超声开5 s停5 s的条件下，复合酶酶活50 U/100 mL的反应体系中，超声波辅助处理0～15 min，然后37 ℃ 孵育4 h。检测不同的超声波处理时间、超声功率和超声频率对酶解产物水解度的影响。使用邻苯二甲醛法检测总蛋白的水解度。

1.2.4 酶解产物的分级分离及清除率检测

将最终的酶解产物分别用1000 Da，5000 Da、10000 Da的超滤管进行离心过滤，分别得到<1000 Da，1000～5000 Da，5000～10000 Da和>10000 Da的酶解产物，用DHHP清除能力检测试剂盒，检测不同分子量大小的酶解产物DHHP自由基清除能力。

2 结果与分析

2.1 藏香猪血液总蛋白的提取

使用血液总蛋白提取试剂盒提取长白猪和藏香猪血液总蛋白，并使用考马斯亮蓝法以及紫外-可见分光光度法测定蛋白质浓度。结果显示，使用试剂盒提取的藏香猪和长白猪血液总蛋白浓度分别为7.9 g/100 mL和8.1 g/100 mL，差异不显著(P>0.05)。A260/280分别为0.57和0.54，蛋白质纯度较高，可用于下一步酶解实验。

2.2 不同酶酶解猪血总蛋白的效果

由于蛋白酶的位点特异性，不同酶酶解同一底物的产物是不同的，因此产物的水解度和抗氧化性也有所差异。为了检验不同蛋白酶酶解猪血蛋白产物的水解度和抗氧化性能，分别用50 U/100 mL 工作浓度的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K或胰蛋白酶：木瓜蛋白酶：胰凝乳蛋白酶(1∶1∶1)复合酶酶解藏香猪血液总蛋白。邻苯二甲醛法检测总蛋白的水解度，用DHHP清除能力检测试剂盒检测其抗氧化能力。

结果显示，单独的胰蛋白酶酶解藏香猪血液总蛋白8 h，水解度达到最大(16.1%左右)(图1A)，木瓜蛋白酶酶解9 h水解度达到最大(10.4%左右)(图1B)、胰凝乳蛋白酶酶解11 h水解度达到最大(9.6%左右)(图1C)，蛋白酶K酶解藏香猪血液酶解4 h水解度达到最大(52.1%左右)(图1D)。复合酶可以实现对藏香猪总蛋白的快速酶解，酶解反应6 h即可达到最大水解度(23.6%左右)(图1E)。

图1 不同酶酶解藏香猪血液总蛋白产物的水解度

对不同蛋白酶酶解藏香猪血液总蛋白的产物进行DHHP清除能力测试显示，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解产物对DHHP清除率在40%左右，蛋白酶K酶解产物对DHHP清除率在20%左右。复合酶酶解产物的抗氧化性能明显优于单独酶解产物，DHHP清除能力可达63.4%以上，是单独酶酶解产物DHHP清除能力的1.5倍以上(图2)。

图2 不同蛋白酶酶解藏香猪血液总蛋白产物对DHHP清除率

2.3 超声波辅助总蛋白酶解效果分析

血液总蛋白的含量较高、粘度较大，使用直接酶解法通常需用较长时间才能达到最大水解度。超声波处理有助于降低蛋白的粘度，增加酶与底物的接触，因此超声波辅助通常认为有助于蛋白质的酶解。为了探究超声波辅助处理对藏香猪血液酶解效果的影响，本研究检测了超声波处理时间、超声波功率、超声波频率对酶解效率的影响。

结果显示，超声功率300 W，超声频率20 Hz的条件下，超声时间9 min 最有利于总蛋白的酶解，酶解产物的水解度可以提升15%，达到23.4%左右(图3A)。超声时间9 min，超声波功率300 W的条件下，超声波频率25 Hz最有利于蛋白质的酶解，最大水解度可达26.4%(图3B)。超声时间 9 min，超声波频率25 Hz的条件下，500 W的超声波功率最有利于蛋白质的酶解，最大水解度可达28.5%(图3C)。同时检测的DHHP清除率显示超声波辅助酶解9 min，超声功率500 W，超声波频率25 Hz时蛋白酶解产物的DHHP清除率最高(图3D-F)。

图3 不同超声波处理因素对藏香猪总蛋白酶解产物的水解度和DHHP清除率的影响

使用工作浓度为50 U/100 mL的复合酶分别酶解长白猪和藏香猪血液总蛋白，在超声波功率500 W，超声波频率25 Hz，超声开5 s停5 s的条件下，超声波处理9 min，然后37 ℃ 孵育4 h。检测长白猪和藏香猪猪血酶解产物的水解度和DHHP清除率。

结果显示，藏香猪和长白猪血液酶解产物水解度分别为28.5%和29.1%，差异不显著(P>0.5)。藏香猪和长白猪血液酶解产物对DHHP清除率分别为71.3%和52.6%，藏香猪血液酶解产物的抗氧化性能明显优于长白猪(图4)。

图4 最优处理条件下长白猪和藏香猪血液酶解产物的水解度和DHHP清除率

2.4 酶解产物的分级分离

超声波辅助藏香猪血液蛋白酶解产物成分比较复杂，不利于后期的应用，使用超滤管收集分子量不同的蛋白组分，对其蛋白含量和对DHHP清除率进行检测。

结果显示，藏香猪血液酶解产物中具有抗氧化活性的部分主要集中于<1 KDa的肽段中，其对DHHP的清除率可达80%左右，随着分子量的增大，其酶解产物对DHHP清除率急剧降低，>10 KDa 的蛋白质组分对DHHP的清除率不足10%。对藏香猪和长白猪血液的酶解产物分别进行超滤分离，发现藏香猪血液的酶解产物中的小分子蛋白浓度高于长白猪，其DHHP清除率比长白猪高20%左右(图5)。

图5 不同分子量大小酶解产物的DHHP清除率

本研究说明使用超声波辅助复合酶酶解法可以有效酶解猪血总蛋白，猪血酶解产物的主要抗氧化肽存在于小分子多态中，藏香猪的血液酶解产物的抗氧化性能优于普通长白猪。

3 讨论

猪血是猪肉屠宰加工行业的副产品，我国作为猪产品使用大国，猪血资源非常丰富，但是对猪血的综合利用多是粗放型的，对猪血中大量的高附价值产品的精制和纯化不足，猪血资源未完全开发。抗氧化肽是猪在生长过程中形成的对抗体内氧自由基损伤的天然产物。目前，虽有多篇文献报道使用酶解、菌酶发酵、酸水解等方法从猪血中提取抗氧化肽，但其使用的猪血多来源于普通商品猪，对特殊环境生存猪的血液研究较少。

藏香猪长期生存在高原环境中，高寒、高海拔、氧分压低的高原环境特点使藏香猪进化出了与之适应的生理性能。藏香猪血液中的γ-谷氨酰基转移酶、碱性磷酸酶含量显著高于长白猪[1]。这说明藏香猪比长白猪具有更强的低氧适应能力、抗氧化应激能力以及高的肌肉活动量，而且藏猪生长的海拔越高，其抗氧化能力越强。从藏香猪中提取的抗氧化肽可能会比普通猪血中提取的抗氧化肽具有更好的抗氧化性，这也为藏香猪血液中抗氧化肽的提取提供了理论依据。

本研究所用超声波辅助复合酶酶解猪血总蛋白，并进行超滤分离获取高活性抗氧化肽的方法，可以快速有效地获取具有较高DHHP清除率和总抗氧化活性的抗氧化肽。通常认为，蛋白质酶解产物的还原能力随着水解度的增加而增加，多肽暴露出的含亲核含硫氨基酸残基(Cys和Met)、芳香族氨基酸残基(Phe、Trp和Tyr)和含咪唑环的组氨酸残基越多，其还原力越强[12,13]。但是本研究发现，蛋白酶水解蛋白后如果肽段过短，其DHHP清除率反而会降低。说明抗氧化肽维持其还原力，除了需要部分氨基酸的作用外，还需要维持一定的空间构象。蛋白酶K对总蛋白的水解度达到50%以上，造成多肽链极短，甚至部分变成游离氨基酸，因此其DHHP清除能力变低。木瓜蛋白酶的特异性较强，单独酶解总蛋白的产物分子量较大，活性氨基酸位点暴露不足，因此还原力较弱。复合酶具有较多的特异性酶解位点，可以充分地暴露具有抗氧化能力的活性氨基酸残基，使其还原力提升。下一步可以使用酶解位点位于活性氨基酸残基周边的蛋白酶对总蛋白进行水解，使Cys、Phe等活性氨基酸残基暴露更充分，从而提升酶解产物的还原力。

从猪血中提取的总蛋白通常粘度较高，不利于酶解反应的发生，超声波处理是常用辅助酶解的手段[14]。本研究发现，使用短时间中等功率的低频超声波处理有利于蛋白的水解，有利于抗氧化肽还原力的提升。这可能是由于过长时间的超声处理会使温度升高，蛋白变性，不利于蛋白的水解和还原力的保持。中等功率的低频超声波还能使蛋白质和酶的接触更为充分，可以降低溶液粘度，促进酶促反应的发生。因此使用超声波处理不仅使酶解反应更充分，还可以加速反应的发生，使整体的处理时间降低，有助于整体技术的工业化应用。

经过酶解的产物实际上是一个富含各种无还原力蛋白、蛋白酶、小分子物质和其他物质的混合物，其性质不稳定，总还原力虽高，但是体积较大，不利于下一步利用。采用超滤的方法将酶解产物根据分子量的不同进行分级分离，结果发现1 KDa以下的酶解产物对DHHP清除率最高，下一步可将制得的还原力较高的蛋白加入保护剂后制成冻干粉，得到性质稳定的抗氧化肽。

本研究以长白猪为对照，优化藏香猪抗氧化肽的提取工艺，发现藏香猪血液总蛋白和长白猪血液总蛋白的含量差异不显著，酶解产物的水解度大致相当，说明二者总蛋白的氨基酸组成差异不显著，特别是本文所使用三种酶识别位点的差异不显著。但是二者DHHP清除能力有显著差异，可能是藏香猪在长期的高原生活中，为了适应高原高寒、低氧的环境特点，特殊的蛋白位点发生了变异，自身的抗氧化性能得到较大的提升，因此水解得到的抗氧化肽活性也较高。对获得高活性抗氧化肽的性质研究，如抗氧化肽对低氧的适应性、对温度和对酸碱的耐受性研究将是我们下一步的工作重点。