2种拮抗云杉梢枯病细菌的抑菌活性研究

曹娜 祝文博 黄麒 刘雪峰

摘 要：用平板对峙法研究贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）和甲基营养型芽孢杆菌（B. methylotrophicus）对云杉梢枯病病原菌寄生小穴壳（Dothiorella gregaria）的抑菌活性，测定2种拮抗菌的生长曲线和不同培养时间、不同体积分数的发酵液抑菌活性及其稳定性，通过光学显微镜研究抑菌机理。结果表明，2种拮抗菌对云杉梢枯病病原菌均有较强的抑制作用，抑菌率分别为57.50%、56.67%。贝莱斯芽胞杆菌发酵液0～12 h对病原菌菌丝体抑菌率几乎为0;24 h抑菌率达到最大56.52%;24～72 h，抑菌率处于43.48%～47.83%。甲基营养型芽孢杆菌发酵液0～12 h对病原菌菌丝体抑菌率几乎为0;24 h抑菌率达到最大52.17%;24～60 h，抑菌率处于47.83%～52.17%;60～72 h，抑菌率有所下降，抑菌率最低为43.48%。2种拮抗菌发酵液的抑菌活性随着体积分数的升高而上升。2种无菌滤液对温度不敏感，经不同酸碱度处理后抑菌活性下降。通过显微镜观察，2种拮抗菌发酵液能使病原菌菌丝发生变粗彭大、表面粗糙等形态变化。

关键词：贝莱斯芽胞杆菌;甲基营养型芽孢杆菌;青海云杉;云杉梢枯病;抑菌活性

中图分类号：S763.15    文献标识码：A   文章编号：1006-8023（2021）03-0072-07

Abstract：The plate confrontation method was used to study the antibacterial activity of Bacillus velezensis and B. methylotrophicus against Dothiorella gregaria， and the grow curve of two kinds of antagonistic bacteria and the antibacterial activity of different incubation time and different concentration were measured. and antibacterial mechanism was studied by optical microscope. The results showed that two kinds of antagonistic bacteria had significant inhibition effect against D. gregaria with the antibacterial rate of 57.50% and 56.67%， respectively. The antibacterial rate of sterile culture filtrate of B. velezensis was nearly 0 from 0 to 12 h. The maximum antibacterial rate was 56.52% at 24 h， and the antibacterial rate was 43.48%-47.83% in 24-72 h. The antibacterial rate of sterile culture filtrate of B. methylotrophicus was nearly 0 from 0 to 12 h. The maximum antibacterial rate was 52.17% at 24 h， and the antibacterial rate was 47.83%-52.17% in 24-60 h. In 60-72 h， the antibacterial rate decreased， and the lowest was 43.48%. The antibacterial activity of two kinds of antagonistic bacteria sterile culture filtrate increased with the increase of the volume fraction. Two kinds of sterile culture filtrate was not sensitive to temperature and the antibacterial activity decreased after different pH treatment. Under the microscope， two kinds of antagonistic bacteria sterile culture filtrate can make hyphae coarsen， bent and enlarged.

Keywords：Bacillus velezensis; B. methylotrophicus; P. crassifolia Kom.; shoot blight of Picea asperata Mast; antibacterial activity

0 引言

青海云杉（Picea crassifolia Kom.）是松科（Pinaceae）云杉屬（Picea）的一种珍贵树种，为乔木，高度可达23 m，是中国特有的树种，主要分布于我国祁连山区、青海、甘肃、宁夏以及内蒙古大青山等海拔1 600～3 800 m的地带[1-5]。该树种木材性质与云杉相似，高大、通直，结构细致易加工，具有极高的观赏价值和经济价值，比如可供建筑、桥梁、家具及木纤维工业原料等用材。

云杉梢枯病病原菌为寄生小穴壳（Dothiorella gregaria），主要侵染青海云杉的嫩梢，导致嫩梢枯死，严重情况会导致整株死亡，给我国青海云杉带来严重的经济损失。大多病害目前都处于物理防治和化学防治阶段，而化学防治长久使用会给环境造成极大的危害，为解决这一问题，寻找低毒或无毒的生物防治方法成为了大趋势[4-10]。

生物防治具有无毒、无污染和无残留等优点，芽孢杆菌近年也越来越多地应用于对各种病害的防治中。贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）和甲基营养型芽孢杆菌（B. methylotrophicus）是革兰氏阳性菌，杆状，能产生芽孢，能抑制多种病害，是理想的广谱生防菌[11-16]。张琼等[17]用贝莱斯芽胞杆菌防治棉花黄萎病，王蕊等[18]从有机质土壤中选育出一株甲基营养型芽孢杆菌BFWR11拮抗赤霉菌、灰霉菌和黑曲霉菌，均取得较好的抑制效果。本文主要研究2种芽孢杆菌对云杉梢枯病的抑菌活性，力求为云杉梢枯病的防治提供更多的参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

云杉梢枯病病原菌寄生小穴壳，分离自宁夏南华山国家级自然保护区的青海云杉枯梢中。贝莱斯芽胞杆菌菌株（以下简称BLS）、甲基营养型芽孢杆菌菌株（以下簡称JY）均分离自东北林业大学帽儿山场部的冷杉叶片中。3者均已分离、纯化、鉴定，保存于东北林业大学林学院病理实验室中。

1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

Luria-Bertani固体培养基（LB）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

LB液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.3 拮抗菌BLS、JY的抑菌活性测定

用平板对峙法进行拮抗菌BLS、JY的抑菌活性测定。用直径5 mm打孔器，于PDA培养基上培养3 d的寄生小穴壳菌落边缘打取菌饼，接于PDA平板中央，在其两侧距中心15 mm处划线接种拮抗菌，以不接种拮抗菌为对照，置于恒温培养箱中，25 ℃培养，每组3个重复。采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率，应用SPSS 10.0软件进行数据分析。

η=（d1-d2）/（d1-5）×100%。

式中：η为抑菌率;d1为对照组菌落直径;d2为试验组菌落直径。

1.4 拮抗菌BLS、JY发酵液不同发酵时间抑菌活性的测定

挑取拮抗菌BLS、JY的单菌落，分别接种于LB液体培养基中，150 r/min，37 ℃摇床震荡培养。每2 h取样一次，分别测其生长曲线。取发酵液，用3层滤纸过滤，再将滤液于超净工作台中过0.22 μm的滤膜，得到2种拮抗菌的无菌滤液，每12 h取样一次，分别测2种拮抗菌无菌滤液对寄生小穴壳的抑菌活性。分别比较2种拮抗菌的生长曲线和抑菌活性随时间变化的关系，以及抑菌活性物质积累的最佳培养时间，以未接菌的LB液体培养基为对照。

1.5 拮抗菌BLS、JY发酵液不同体积分数抑菌活性的测定

取摇培24 h的2种无菌滤液，混于50 ℃的PDA中，分别制成1%、10%、20%、30%、40%、50%体积分数的带药平板，用直径5 mm的打孔器，于培养3 d的寄生小穴壳菌落边缘打取菌饼，接种于带药平板的中央，每组3个重复，置于25 ℃恒温培养箱中培养3 d后，测菌丝直径，计算抑菌率。

1.6 拮抗菌BLS、JY发酵液抑菌活性稳定性的测定

酸碱处理对发酵液抑菌活性的影响：取5份相同体积的BLS、JY无菌滤液，分别用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH将无菌滤液的pH调节为5、6、7、8、9，静置2 h后再将pH调至7，过0.22 μm的滤膜[19]，以未处理的无菌滤液为对照，测抑菌活性，每组3个重复。

热处理对发酵液抑菌活性的影响：分别取5份相同体积的BLS、JY无菌滤液，分别用0、20、40、60、80 ℃水浴锅处理30 min[19]，以未处理的无菌滤液为对照，测抑菌活性，每组3个重复。

1.7 拮抗菌BLS、JY发酵液对寄生小穴壳菌丝生长的影响

用直径5 mm的打孔器，于PDA培养基上培养3 d的寄生小穴壳菌落边缘打取菌饼，接种于分别加入体积分数50%的BLS、JY发酵液的PDA平板中央，以加入体积分数50%的LB液体培养基的PDA平板为对照，置于25 ℃恒温培养箱中培养3 d后，挑取菌落边缘菌丝，制成水载片，在显微镜下观察菌丝形态特征。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌BLS、JY对寄生小穴壳的抑制作用

通过平板对峙的结果可以观察到：2种拮抗菌BLS、JY菌体均对寄生小穴壳的生长有抑制作用。抑菌率分别为57.50%±1.44%、56.67%±2.36%。如图1所示。

2.2 拮抗菌BLS、JY的生长曲线及抑菌活性随时间的变化

对拮抗菌BLS进行生长曲线的测定，以求反映出菌体的生长状况。结果如图2所示。拮抗菌BLS在0～4 h为迟缓期，4～26 h为对数期，26 h后进入稳定期，48 h后进入衰亡期。对每12 h的BLS无菌滤液进行抑菌效果测定，结果表明，0～12 h时间段内BLS无菌滤液对寄生小穴壳几乎无抑制作用，抑菌率为0;在24 h时，抑菌率达到最大;24～72 h，抑菌率有所下降;72 h时抑菌率最低。此结果表示，BLS无菌滤液在不同时间段里抑菌效果差异显著（P<0.05）。

对拮抗菌JY进行生长曲线的测定，结果如图3所示。拮抗菌JY在0～4 h为迟缓期，4～36 h为对数期，36 h后进入稳定期，48 h后进入衰亡期。对每12 h的JY无菌滤液进行抑菌效果测定，结果表明，0～12 h时间段内JY无菌滤液对寄生小穴壳无抑制作用，抑菌率为0;在24 h时，抑菌率达到最大;24～72 h，抑菌率均有所下降。此结果表示，JY无菌滤液在不同时间段里抑菌效果差异显著（P<0.05）。

2.3 拮抗菌BLS、JY发酵液不同体积分数的抑菌活性

拮抗菌BLS不同体积分数发酵液无菌滤液，对寄生小穴壳菌丝的抑菌活性如图4所示。随着发酵液无菌滤液体积分数的上升，对病原菌的抑菌活性明显升高。其中体积分数为50%时，抑菌效果最好，抑菌率为70.37%±2.62%。

拮抗菌JY不同体积分数发酵液无菌滤液，对寄生小穴壳菌丝的抑菌活性如图5所示。随着发酵液无菌滤液体积分数的上升，对病原菌的抑菌活性明显升高。其中体积分数为50%时，抑菌效果最好，抑菌率为68.52%±2.62%。

2.4 拮抗菌BLS、JY发酵液抑菌活性的稳定性

2种拮抗菌的发酵液，经不同酸碱度处理后，对寄生小穴壳菌丝生长的抑制作用均有所减弱，差异显著;经0、20、40、60、80 ℃水浴锅处理30 min后，BLS对寄生小穴壳菌丝生长的抑制作用变化显著，JY对寄生小穴壳菌丝生长的抑制作用变化不显著。如图6和图7所示。

2.5 拮抗菌BLS、JY发酵液无菌滤液处理后寄生小穴壳菌丝的变化

经2种发酵液处理后，病原菌分别出现菌丝变粗彭大、表面粗糙的变化。说明2种拮抗菌发酵液对寄生小穴壳菌丝的生长有一定的抑制作用。如图8所示。

3 结论与讨论

在本研究中，2种拮抗菌发酵液对云杉梢枯病病原菌寄生小穴壳（D. gregaria）的菌丝均有抑制作用，最大抑菌率分别为57.50%±1.44%、56.67%±2.36%，且在发酵24 h时抑菌效果最佳。这说明了在2种拮抗菌的发酵过程中，确实都产生了能够抑制寄生小穴壳菌丝生长的次生代谢产物。由此可得，2种拮抗菌发酵后，对于抑制云杉梢枯病病原菌寄生小穴壳具有极高的应用价值。同时对2种拮抗菌的拮抗作用和抑菌活性进行了研究，体积分数为50%时，2种拮抗菌抑菌效果最好，抑菌率分别为70.37%±2.62%、68.52%±2.62%，这为下一步抑菌活性物质的提取鉴定、发酵条件优化和田间防治等提供了良好的基础。

2种拮抗菌的发酵产物经酸碱、热等处理，均具有较好的稳定性，这为未来研发为生物制剂提供了良好的依据。通过显微镜观察发现，分别经2种拮抗菌发酵液处理后的病原菌，菌丝发生了变粗彭大、表面变粗糙等变化。具体的抑菌机制还有待进一步的研究。

使用生物防治不仅有无毒无害的优点，还具有无残留等优点，是未来病害防治必然要采取的措施之一，贝莱斯芽胞杆菌和甲基营养型芽孢杆菌对林木病害的防治具有广谱性，对多种病害都有抑制作用，如赵昱榕等[20]用从黄瓜植株体内分离鉴定出的贝莱斯芽胞杆菌（B. velezensis）抑制多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）。本研究中使用贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）和甲基营养型芽孢杆菌（B. methylotrophicus）分别拮抗云杉梢枯病的病原菌寄生小穴壳（D. gregaria），均取得较好的抑菌效果。在国内，尚比较少见用这2种拮抗菌拮抗云杉梢枯病的相关报道，以期本研究能为云杉梢枯病的防治提供更多的依据。

【參 考 文 献】

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