冠状动脉缺血再灌注对循环微粒的影响

王旭兰，张炜，李喆，王亚萍，吴皓宇，王群让，邢坤，常凤军，王英

急性心肌梗死（AMI）是在冠状动脉（冠脉）发生狭窄的基础上因各种诱因（如劳累、情绪波动等）导致斑块破裂而激活血小板，激活的血小板进一步刺激更多的血栓形成和产生缩血管物质，最终致使冠脉持续性缺血缺氧和心肌坏死。临床多表现为剧烈而持续的胸痛，同时伴血清心肌酶活性增高及心电图动态演变，有极高的致死率[1]。循环微粒（MPs）是机体在各种刺激诱导下由内皮细胞、血小板等血管源细胞释放的微小颗粒，既往研究发现MPs与内皮功能损坏密切关系[2,3]。AMI的有效处理方式是冠脉介入治疗，但AMI患者行冠脉介入治疗时缺血再灌注是其常见并发症，缺血再灌注时各种炎症因子释放和血小板的激活是否会影响MPs的功能和数量目前尚未报道。本研究通过比较行冠脉介入治疗的稳定型心绞痛及AMI患者（发生缺血再灌注者）的MPs功能及数量的差异，探讨MPs在心肌缺血再灌注中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象本实验为前瞻性研究，实验组为2017年2～7月就诊于陕西中医药大学附属医院心血管内科的AMI患者30例，年龄40～62（48.62±10.41）岁，排除2型糖尿病、高血压、肾功能衰竭、严重感染性疾病等患者。对照组为同期就诊的稳定型心绞痛患者30例，年龄42～65（50.79±11.38）岁。所有参与者均签署知情同意书，本研究通过我院伦理委员会批注。

1.2 MPs提取冠脉介入治疗结束时抽两组患者的冠脉血（实验组抽取缺血再灌注时冠脉血液），依参考文献提取MPs：血液标本低温送至医院实验中心，离心（4℃ 4000 rpm，10 min）后提取上层血浆再次离心（4℃ 11 000 g，2 min），离心后上层血浆为乏血小板血浆。取乏血小板血浆2 ml行最终离心（4℃ 13 000 g，45 min）。最后MPs将沉淀于离心管底部，用RPMI1640培养基（美国，GIBCO公司，100 μl）重新悬浮MPs。BCA蛋白浓度测定试剂盒（美国，Thermo Scientific 公司）测定MPs浓度后将其存放于4℃冰箱（中国，海尔公司）备用。

1.3 MPs来源检测按文献[4]报道采用流式细胞仪检测MPs来源：取乏血小板血浆50 μl与5 μl anti-CD31-PE抗体和5 μl anti-CD41-FITC抗体（美国，Beckman Coulter公司）在室温下孵育30 min。孵育结束后取50 μl流量计数仪珠（美国，Beckman Coulter公司）加入到孵育好的抗体标记MPs中，对样品进行分析。内皮来源的MPs（EMP）被定义为CD31（+）/（-），血小板来源（PMP）的MPs被定义为CD41 CD31（+）/（+）。

1.4 一氧化氮（NO）检测6只雄性SD大鼠（180±10 g，本研究通过陕西中医药大学附属医院伦理委员会审核，动物使用批准号：SYXK2016-006），经斩头处死后取胸主动脉放置于预冷并通气的Kreb’s平衡液（NaCl 119.0 mmol/L，NaHCO325.0 mmol/L glucose 11.1 mmol/L，CaCl21.6 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L和MgSO41.2 mmol/L， PH 7.4）中，小心剔除动脉周围脂肪组织后纵行剖开血管，将血管放入含有DMEM培养基（美国，GIBCO公司）的6孔板内并置于细胞培养箱内稳定1 h，加入等量的两组MPs孵育血管30 min（空白对照组血管不做任何处理）。用NO检测试剂盒（中国，南京建成生物科技公司）检测各组培养基中NO含量，各组血管烘干称重用于计算单位重量NO含量。

1.5 统计学方法采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，Graph pad prism5进行作图。两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较两组除在MPs含量上有差异外，在性别、年龄、血脂、体质指数等方面比较，均无明显统计学差异（表1）。

表1 两组一般临床资料

2.2 MPs来源检测与对照组比较， 实验组MPs中血小板来源（PMP，黄框，46.52%±8.37%）及内皮细胞来源（EMP，绿框，32.81%±6.58%）MPs均增多，其中以PMP增多更为显著（图1）。

图1 MPs来源检测

2.3 MPs对NO含量的影响与空白组比较，对照组MPs抑制离体血管NO产生；而实验组MPs较对照组进一步抑制了离体血管NO的产生（图2）。

图2 MPs对NO含量的影响

3 讨论

本文通过比较AMI患者MPs与稳定型心绞痛患者MPs含量与功能发现，患者行冠脉介入治疗发生缺血再灌注时MPs含量明显升高，升高的MPs以PMP为主，且明显抑制离体大鼠胸主动脉NO的产生。

AMI的发病率随着我国经济发展呈上升趋势，AMI逐渐成为危害我国人民生命健康的重要疾病。研究发现：血小板激活、炎症因子活化、内皮功能紊乱在AMI的发生发展中起重要作用[5]。先前研究[6]发现：MPs不但能抑制内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的活化影响血管新生，还能加强高脂血症对血管新生的抑制作用。李芸等[2]研究发现：急性ST段抬高性心肌梗死患者体内MPs水平较正常人升高，且其体内的MPs通过抑制eNOS活化和上调内皮素-1（ET-1）表达导致内皮功能紊乱。Ahn研究[7]显示：主动脉瓣狭窄致使体内MPs含量升高，而体内升高的MPs通过损害内皮功能反过来加重主动脉瓣膜损伤而形成“恶性循环”。本研究着眼于MPs与AMI在内皮、血小板上的共性，研究发现：AMI患者行冠脉介入治疗发生缺血再灌注后致使冠脉内MPs含量升高，升高的MPs多数来源于血小板激活。

NO含量下降和氧化应激反应的增强是反应内皮功能受损的重要指标。既往研究[8]发现，冠心病患者MPs可抑制离体大鼠胸主动脉NO的产生和内皮依赖的血管舒张功能。既往研究[3]还显示：肺动脉高压大鼠体内MPs含量随肺高压病情进展而升高，且升高的MPs通过抑制eNOS活化和促进弹性蛋白表达参与了肺高压的发生发展。缺血再灌注导致冠脉血中升高的MPs对离体大鼠胸主动脉NO的产生有更强的抑制力，阐明了冠脉缺血再灌注时的机理。

综上所述，缺血再灌注时机体冠脉内内皮及血小板来源的MPs水平升高，升高的MPs抑制了血管产生和释放NO的能力，MPs的这一作用可能会进一步加重冠脉缺血再灌注，形成恶性循环。为寻求新的和更有效的预防和缓解缺血再灌注的方法影响提供了理论依据。