双歧杆菌乳杆菌三联活菌干预NASH模型大鼠代谢性炎症的实验研究*

崔 翔 邢宇锋 何堂清 姜小艳 盛国光△

1.安康市中医医院肝病科 (陕西 安康， 725000) 2.深圳市中医院暨广州中医药大学第四临床医学院肝病科 3.湖北省中医医院肝病科

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种与胰岛素抵抗(IR)和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏损伤，其疾病谱包括非酒精性肝脂肪变、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。NAFLD是常见的慢性肝病，普通成人中NAFLD患病率介于6.3%～45%，其中10%～30%为NASH[1]，且发病年龄有低龄化趋势，严重危害人类身心健康，是目前全世界范围内面临的公共健康问题之一。近10余年来，随着肠道微生态学研究的快速进展及对“肠-肝”轴生理病理认识的深入，发现NAFLD的发病机制与肠道微生态环境紊乱密切相关。基于此，有学者提出了“多重打击学说”[2]，其主要观点包括肠道菌群失调及与之相关的内毒素血症、代谢性炎症学说。NASH是NAFLD病程进展中最为关键的阶段，需要在改善生活方式的基础上及时进行药物干预。本研究采用高脂饮食诱导的NASH大鼠模型,应用双歧杆菌乳杆菌三联活菌干预，观察其对NASH模型大鼠的防治作用，并重点探讨其对代谢性炎症的影响，以期为益生菌防治NASH提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级6周龄雄性SD大鼠32只[动物许可证号:SCXK(鄂)2015-0018]，体重180～200 g，购自湖北省实验动物研究中心。自由进食、饮水，喂标准颗粒饲料，室温18～22℃，相对湿度55%，采用标准化光照。

1.2 动物饲料

1.2.1 标准饲料 主要营养成分指标：水分≤10%，钙1.0%～1.8%，磷0.6%～1.2%，钙磷比：1.2∶1，粗脂肪≥4%，粗纤维≤5%，赖氨酸≥8.2%，粗灰分≤8%，蛋氨酸≥0.53%，粗蛋白≥18%。

1.2.2 高脂饲料 由标饲料按比列加工配制而成。其中糖∶脂肪∶蛋白供能比例为33%∶50%∶17%。成份构成：普通词料60%，猪油22%，蔗糖6%，酪蛋白5%，玉米蛋白粉3%，胆固醇2%，磷酸钙1.6%，添加剂0.4%。由武汉万千佳兴生物科技有限公司按照配方加工而成。

1.3 药物 双歧杆菌乳杆菌三联活菌片(内蒙古双奇药业股份集团有限公司生产，批号：130318，规格：0.5 g/粒)。采用0.9%氯化钠溶液溶解配成100 mg/ml的溶液，于4℃冰箱保存备用，现配现用。

1.4 主要试剂及仪器 游离脂肪酸(FFA)测试盒(A042，南京建成生物工程研究所)、甘油三酯(TG)测试盒(A110-2，南京建成生物工程研究所)。Rat IL-1βELISA Kit(RA20020，Bioswamp)；Rat TNF-a ELISA Kit(RA20035，Bioswamp)，鲎试剂盒(140325，厦门鲎试剂有限公司)。7170全自动生化分析仪(日本日立公司)；Multiskan MK3全自动酶标仪(Thermo scientific)；752紫外分光光度计(上海舜宇恒仪器有限公司)。

1.5 动物分组与造模干预 32只雄性SD大鼠，称重后按随机数字表法随机分为3组，其中正常对照组、益生菌干预组各8只，模型对照组16只。经适应性喂养3 d后，模型对照组、益生菌干预组均给予高脂饮食饲养，正常对照组以标准饲料喂养。每4周从模型对照组随机选取2只大鼠处死以动态评估模型的复制情况，经HE染色证实第4周末模型对照组大鼠复出现肝脂肪变，于实验第5周开始，益生菌干预组大鼠给以双歧杆菌乳杆菌三联活菌片溶液0.7 g·kg-1d-1灌胃，正常对照组和模型对照组大鼠予以等剂量的0.9%氯化钠溶液灌胃，根据大鼠体重变化调整给药剂量，连续灌胃12周。

1.6 标本采集 实验第16周，末次给药后24 h，先称取各组大鼠体重，记录一般情况后，采用0.2 g/ml的乌拉坦腹腔注射麻醉，处死后采集分别采集血液、肝脏组织标本，保存待检。

1.7 检测指标

1.7.1 血清ALT、AST的检测 腹主动脉取血后，室温静置30 min，3 000 r/min离心10 min，分离血清，按操作步骤，进行ALT、AST检测。

1.7.2 肝脏匀浆组织TG、FFA的检测 肝脏标本用0.9%氯化钠冲洗3次，除去肝脏包膜。剪取同一部位，并准确称量100 mg肝组织剪碎，用0.9%氯化钠冲洗至表面无血色为止，然后放入含0.2 ml 0.9%氯化钠的塑料离心管内，捣碎研磨制成10%组织匀浆。向匀浆中加入0.8 ml的氯仿-甲醇(1∶1)抽提液充分混匀。按将制备好的匀浆行离心后按照试剂盒操作进行检测。

1.7.3 血浆LPS的检测 在无菌技术下，抽取门静脉血1 ml，装入无热原抗凝管，3 000 r/min，离心3 min，取上清液标本，按照鲎试剂盒说明书操作步骤检测。

1.7.4 血清IL-1β、TNF-α的检测 采用双抗体夹心ELISA法，按试剂盒操作说明书操作步骤测定。

2 结果

2.1 各组大鼠肝脏HE染色情况 见图1(A-C×200)。经HE染色和血清ALT、AST检测证实于实验第16周复制成NASH模型。正常对照组大鼠肝小叶结构完整；肝索呈放射状分布于中央静脉周围，整齐排列，肝窦清晰可见；肝细胞大小均匀，核结构清晰，细胞内少有脂质沉积。模型对照组肝组织呈重度弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性，可见气球样变，部分肝小叶内有坏死灶，汇管区可见显著的炎性细胞浸润，并向小叶内延伸，部分标本有明显的炎性细胞浸润。益生菌干预组也可见不同程度弥漫性肝细胞脂肪变及炎症，但较模型对照组有明显改善。

图1 各组大鼠第16周肝脏HE染色(×200)

2.2 各组大鼠血清ALT、AST的比较 见表1。

表1 各组大鼠血清ALT、AST情况的比较 (U/L)

2.3 肝脏组织匀浆TG、FFA含量比较 与正常对照组比较，2个高脂造模组大鼠肝脏匀浆TG、FFA水平明显升高(P<0.01或P<0.05)。与模型对照组相比，益生菌干预组大鼠肝脏匀浆TG、FFA水平均显著降低(P<0.01或P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠肝脏匀浆TG、FFA浓度的比较

2.4 各组小鼠血浆LPS水平的比较 相对正常对照组，模型对照组和益生菌干预组血浆LPS均显著升高(P<0.05)，而与模型对照组比较，益生菌干预后可明显降低血浆LPS的水平(P<0.05)，见表3。

2.5 各组小鼠血清IL-1β、TNF-α水平的比较 与正常对照组比较，模型组和益生菌组血清TNF-α、IL-6的水平均升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，益生菌干预组IL-1β(P<0.05)，和TNF-α(P<0.05)水平较模型组显著降低， 见表3。

表3 各组大鼠血清IL-1β、TNF-α和血浆LPS水平的比较

3 讨论

针对NAFLD的治疗，最新的国内外指南推荐意见中尚无疗效显著且安全的药物，目前临床常用的药物包括胰岛素增敏剂、保肝药物、调节血脂药、抗氧化剂等[3]。

由于IR是NAFLD发生发展的主要机制之一，改善IR是治疗NAFLD的关键之一，二甲双呱是临床中最常用胰岛素增敏剂之一，近期研究证据显示其改善IR的作用机理与调节肠道菌群密切相关[4-6]。2015年由哈佛大学、耶鲁大学联合发布的《益生菌应用建议:进展与共识(更新版)》首次增加了VSL#3、LGG等益生菌在成人和儿童NAFLD患者中的应用推荐[7]。因此，可以预见肠道靶向微生态调节剂将是未来NAFLD的防治的重要策略之一[8]。双歧杆菌乳杆菌三联活菌片包含长型双歧杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌3种活性成分，是临床上最常用且安全、经济的肠道益生菌组合。本研究采用高脂饲料于第4周末复制成SD雄性大鼠非酒精性脂肪变模型，历时16周成功诱发NASH模型，经检测证实其病理和转氨酶改变亦符合人类NASH的临床诊断标准[9]。于实验第5周开始给予双歧杆菌乳杆菌三联活菌片干预观察其对NASH的防治效果。研究发现双歧杆菌乳杆菌三联活菌片干预组大鼠血清中ALT、AST水平、肝脏匀浆TG、FFA的含量明显低于模型对照组，表明双歧杆菌乳杆菌三联活菌片可降低模型大鼠升高的血清转氨酶、改善肝脏脂质代谢紊乱，对高脂饲料诱发的NASH模型大鼠的疾病进展确有一定的防治效果。

“肠-肝轴”构成了肠-肝之间生理联系的基础，而脂多糖(LPS)则是沟通肠-肝损伤的病理中介。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁外层的主要成分，也是循环内毒素的主要成分，来源于肠道的LPS，经由门静脉进入到肝脏，当超过肝脏的代谢能力，即形成代谢性内毒素血症。LPS不仅可以直接造成肝脏损害，而且可以诱导机体产生大量TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子及炎症介质的表达，引起代谢性炎症，进一步加重肝脏及其他组织、靶器官的损伤。近年来提出的“代谢性炎症”的概念认为，营养代谢性因素导致的肠道菌群失调产生的毒素进入血液，可以引起全身长期系统性、低水平的慢性炎症，而这种炎症缺乏传统意义上炎症“红、肿、热、痛”的典型表现，可以导致包括NAFLD、肥胖、2型糖尿病、动脉粥样硬化、胰岛素抵抗等在内的营养代谢性疾病的发生[10,11]。基于此，国内学者首次提出“代谢性炎症综合征(MIS)”的概念及诊断思路，建议将伴有2个及以上代谢性疾病的患者整合定义为MIS[12,13]。本研究发现高脂饲料诱发的NASH模型大鼠血浆LPS和血清炎症因子IL-1β、TNF-α水平显著升高，证实模型大鼠体内存在内毒素血症和代谢性炎症，经双歧杆菌乳杆菌三联活菌干预组后大鼠门静脉血浆中LPS水平、血清炎症因子IL-1β、TNF-α水平亦相应下降，证实双歧杆菌乳杆菌三联活菌片在一定程度上可以改善NASH模型大鼠的代谢性炎症。

综上，本研究表明双歧杆菌乳杆菌三联活菌可以改善高脂诱发的NASH模型大鼠的肝功能和脂质代谢，对大鼠的NASH有确切的防治效果，其作用机制可能与其调节NASH模型大鼠肠道菌群，改善内毒素血症、代谢性炎症密切相关，其对NASH模型大鼠肠黏膜微生态屏障影响的详细机制研究有待进一步深入。