重视慢性乙型肝炎临床管理中的低病毒血症

赵西太 聂青和

空军军医大学唐都医院感染病科(全军感染病诊疗中心) (陕西 西安, 710038)

低病毒血症(LLV)这一概念引入慢性乙型肝炎治疗领域已十余年，相关研究逐渐增多，随着抗病毒治疗的进步，LLV在慢性乙型肝炎治疗管理中的重要性更加凸显，引起了相关领域专家们的重视。为此，2018年美国肝病研究协会(AASLD)发布的慢性乙型肝炎防治指南中专门给出了持续LLV的管理建议[1]。

1 LLV概述

低病毒血症(LLV)的概念来源于艾滋病研究领域，定义为人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者血浆中持续可测但低于1 000拷贝/ml的病毒载量。多项研究发现[2]，接受高效联合抗反转录病毒治疗但出现LLV的HIV感染者中，随访中大部分病例会发生与抗反转录病毒治疗相关的耐药突变，且LLV与HIV病毒学进展和HIV感染者的病情进展相关。与HIV类似，乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染者体内病毒难以彻底清除。HBV慢性感染主要发生于围生期及幼年，HBV复制过程中部分DNA可形成半衰期较长的共价闭合环状DNA作为复制模板，加上感染过程中抗病毒相关细胞免疫功能受损，HBV在患者体内持续存在，需要长期进行抗病毒治疗[3]。慢性HBV感染者接受抗病毒治疗后，血清HBV DNA载量可快速下降，但在早年间，由于实验室检测灵敏度不足，血清HBV DNA载量检测下限较高(1 000拷贝/ml或更高)，因此，确定HBV DNA“转阴”的患者，其血清HBV DNA真实水平未知。近年来，HBV DNA检测技术快速进步，可检测到20 IU/ml或更低水平的HBV DNA，因而临床上发现相当比例的乙型肝炎患者血清HBV DNA长期维持在低水平，因此有学者引入LLV的概念并加以研究。考虑到非活动性慢性乙型肝炎患者HBV DNA水平通常低于2 000 IU/ml，目前多将LLV定义为HBV DNA持续或偶尔可测到，但<2 000 IU/ml[1]。

慢性乙型肝炎LLV的定义涉及HBV DNA的定量检测，因此检测方法及计量单位应当力求规范、统一，以利于不同实验室检测结果之间进行比较。HBV DNA定量检测方法较多，如实时定量PCR法和既往使用的分枝链DNA法、捕获杂交法、液相杂交法和分子信标法等，检测结果多以“拷贝/ml”为计量单位，不同检测方法得到的结果通常无法换算、无法进行对比，不利于临床应用[4]。WHO于1995年设立基因组扩增技术标准化国际工作组，为输血安全领域重要血液传播病原体的核酸检测设定统一的国际标准，后来其工作范围扩展到临床上常见感染性疾病的诊断和监测[5]。工作组制作待检病原体基因组核酸标准品，供全球微生物学实验室和检测试剂生产商作为一级参比样品，并规定国际单位(IU)作为参比样品的计量单位，该计量单位来源于对第一批标准品的物质量的规定，例如，1999年制作的第一批HBV DNA冻干标准品的量规定为500 000 IU/瓶，稀释后浓度单位通常记作IU/ml，这样，IU/ml就可作为统一的衡量病原体浓度的单位，有利于不同实验室检测结果的直接比较。当前使用的HBV DNA标准品是2016年制作的替代品，含量为477 500 IU/ml。目前HBV DNA定量检测多用实时定量PCR-荧光探针的方法，所用商品化试剂测得的结果通常以IU/ml标示，单位换算关系通常为1 IU/ml≈5拷贝/ml，但具体到不同试剂或有所不同，换算系数要参考试剂使用说明书。由于不同实验室检测HBV DNA灵敏度有所不同，为更准确地鉴定LLV，应尽可能选用检测下限最低的实验室检测方法。

2 LLV的流行病学

乙型肝炎治疗领域内LLV是一个比较新的概念，LLV在未治疗和治疗的患者中发生率尚无准确统计数据，但其流行强度可以从抗HBV治疗效果的临床研究中略窥一斑。重庆医科大学主持开展的一项大型多中心随机对照试验(RCT)，对比替诺福韦和恩替卡韦在HBeAg阳性初治慢性乙型肝炎患者中长期抗病毒疗效，随访至144周时，两组中分别有91.7%(144/157)和86.7%(137/158)的患者HBV DNA低于检测下限(20 IU/ml)[6]。北京大学人民医院开展的一项真实世界研究(RWS)评估了恩替卡韦的长期疗效，治疗至60个月时，94.4%(220/233)的患者获得病毒学应答(HBV DNA<20 IU/ml)[7]。这两项研究中，抗病毒治疗较长时间(3～5年)后，仍有5%～10%的患者未达到病毒学应答，不排除其中相当比例的LLV患者存在。

有些研究部分披露了核苷(酸)类似物治疗过程中的LLV发生情况。两项大型国际多中心RCT对比丙酚替诺福韦(TAF)和替诺福韦的抗HBV疗效，随访至96周时，HBeAg阳性患者中TAF组和替诺福韦组HBV DNA低于检测值下限(29 IU/ml)的比例分别为72.8%(423/581)和74.7%(218/292)，HBV DNA≥29 IU/ml且<69 IU/ml的比例分别为4.8%(28/581)和2.1%(6/292)；而HBeAg阴性患者为90.2%(257/285)和90.7%(127/140)，HBV DNA≥29 IU/ml且<69 IU/ml的比例分别为1.8%(5/285)和2.1%(3/140)[8]。该研究的数据表明，TAF和替诺福韦治疗96周后，至少有3.9%的患者存在LLV。日本学者2019年发表一项多中心回顾性队列研究，其入组患者基线资料表明，接受恩替卡韦单药治疗、核苷(酸)类似物联合治疗(拉米夫定+阿德福韦酯、拉米夫定+替诺福韦、恩替卡韦+阿德福韦酯、恩替卡韦+替诺福韦)的成年慢性乙型肝炎患者中，治疗2年及以上者，明确出现LLV者分别占比19.9%(38/191)和7.4%(9/122)[9]。

根据现有临床研究数据推测，在核苷(酸)类似物治疗较长时间后，LLV仍较常见。由于我国慢性乙型肝炎患者众多，LLV群体规模或相当巨大，确有必要尽快厘清LLV的临床意义，以指导慢性乙型肝炎的临床管理。

3 LLV的临床意义

3.1 LLV与肝纤维化进展 HBV感染是肝纤维化/肝硬化的明确的危险因素，2006年的一项研究表明，全世界范围内的肝硬化患者中，约有30%与HBV感染有关[10,11]。HBV不直接杀伤肝细胞，而是机体对受感染的肝细胞的免疫反应引发肝细胞损伤和长期的肝脏慢性、持续的炎症，但机体该免疫反应并不能有效清除HBV，长此以往，便可导致肝硬化[12,13]。持续性的HBV高载量是肝硬化发病较大危险因素，尤其是HBV DNA在106拷贝/ml以上者，但HBV DNA水平较低的患者仍可发生肝硬化[14,15]。

由首都医科大学附属北京友谊医院的一项前瞻性队列研究，探索慢性乙型肝炎抗病毒治疗过程中LLV与肝纤维化进展的关系，研究结果于2020年发表[16]。研究者纳入379例成年慢性HBV感染初治患者，无失代偿性肝病及肝脏肿瘤，其中HBeAg阳性者HBV DNA >20,000 IU/ml，HBeAg阴性者HBV DNA>2 000 IU/ml，研究期间所有患者接受恩替卡韦治疗，入组时及以后每26周进行一次实验室检查，肝活检于入组时及随访78周时各进行一次，最终有239例完成78周随访研究并被纳入分析。结果表明，78周时约30%患者的HBV DNA未转阴(>20 IU/ml)，HBV DNA未转阴者有27%发生肝纤维化进展，而HBV DNA转阴者有6%发生肝纤维化进展。对于基线Ishak评分≥3分的患者，HBV DNA未转阴、饮酒是肝纤维化进展的独立危险因素，比值比(odds ratio，OR)分别为4.84(1.30～17.98)、23.84(2.68～212.50)。具体分析，纤维化进展型患者的HBV DNA未转阴率(50.0%)高于纤维化逆转型患者(19.1%)和纤维化中间型患者(26.1%)。另外，根据Ishak评分进行的配对分析中，肝纤维化进展的19例患者中有52.6%(10/19)HBV DNA未转阴，而肝纤维化逆转的患者中仅有21.1%(4/19)，且多数未转阴患者的病毒载量居于20～200 IU/ml之间。基于上述结果，研究者认为慢性乙型肝炎患者使用恩替卡韦治疗78周时低水平的残存HBV或可继续促进肝纤维化进展。不过，该研究失访率过高(36.9%，140/379)，随访时间较短，恐难以避免肝纤维化和抗病毒效果的长期波动性对研究结论的影响，且未明确文题中所说“低水平HBV”的具体限值。因此，对于LLV能否促进肝纤维化这一问题，该研究的结论应作慎重解释。来自土耳其2018年发表的一项病例对照研究发现，年轻的慢性乙型肝炎LLV患者中有较高比例发生显著肝纤维化[17]。研究纳入了273例19～40岁、男性、HBeAg阴性、ALT升高、无其他肝病、未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者，进行肝活检及HBV DNA等实验室检测，将患者分为LLV组和对照组(HBV DNA>2 000 IU/ml)进行统计学分析，观察患者肝脏显著组织学异常的情况，包括显著坏死性炎症和显著肝纤维化，前者要求组织活动指数(HAI)≥4，后者为Ishak评分≥2。结果显示，有139例患者表现为LLV，134例患者HBV DNA>2 000 IU/ml，其中，LLV患者的显著炎症性坏死和显著肝纤维化发生率分别为44.6%(62/139)和30.2%(42/139)，而照组中两者发生率则较高，分别为62.7%(84/134)和55.2%(74/134)。该研究表明，有肝炎活动而未经治疗的年轻男性慢性乙型肝炎患者中，即使HBV DNA载量较低，肝脏组织学病变包括显著肝纤维化的发生率也相当高。因此，持续LLV的危害不容小觑。

除了上述活动性慢性乙型肝炎，浙江省人民医院于2016年发表的一项研究观察了HBeAg阴性非活动性慢性乙型肝炎患者LLV与肝脏组织病理学变化的关系[18]。研究纳入了102例成年、HBeAg阴性、ALT正常、未经治疗、无其他肝病的慢性乙型肝炎LLV患者，进行血清学和肝组织学检查。结果表明，患者队列中发生显著肝组织学病变的比例高达38.2%(39/102)，包括22.5%(23/102)的Metavir评分2～3级的肝纤维化和24.5%(25/102)的中重度炎症。可见，非活动性慢性乙型肝炎LLV患者中也存在较高比例的显著肝脏组织学病变。

此外，2016年发表的一项来自巴西的小样本横断面研究也得出了类似结论，ALT轻度升高<2×正常值上限(ULN)的慢性乙型肝炎患者中，40.7%(11/27)表现出较重的肝损伤(Metavir评分>2)[19]。

综上，无论是未经治疗的慢性乙型肝炎LLV，还是抗病毒治疗过程中未达到病毒学应答导致的LLV，均可能继续促进肝纤维化进展。近年来，瞬时弹性成像技术已成为一种成熟而较为可靠的肝纤维化无创诊断技术，临床上广泛用于诊断显著肝纤维化、进展期肝纤维化及肝硬化[20]。因此，对于LLV患者，定期监测，以评估是否启动或调整抗病毒治疗，是改善慢性乙型肝炎患者整体预后的必要措施。

3.2 LLV与肝细胞癌(HCC) 肝硬化是HCC的主要危险因素，在HBV相关的肝硬化患者中，高载量HBV DNA是HCC发生的独立危险因素[1, 21]。近几年的研究发现，LLV也与HCC的发病有关系。韩国研究人员2017年报道了一项回顾性队列研究，探讨了恩替卡韦治疗过程中的慢性乙型肝炎患者LLV与HCC发生的关系[22]。研究纳入875例恩替卡韦单药初治的成年慢性乙型肝炎患者，病例入组前HBV DNA≥2 000 IU/ml，且在接受恩替卡韦治疗后维持HBV DNA<2 000 IU/ml，随访中按照HBV DNA水平将患者分为两组，持续病毒学应答(MVR)组和LLV组，其中MVR指HBV DNA持续阴性(HBV DNA<12 IU/ml)。结果显示，MVR组中HCC的3年和5年累计发生率分别为3.2%和7.5%，均低于LLV组的6.2%和14.3%，LLV是发生HCC的危险因素，相对于MVR的风险比为1.98(1.28～3.06)。亚组分析显示，伴有肝硬化的MVR组和LLV组患者的5年发病率更高，分别为10.3%和23.4%，调整年龄、性别、HBeAg和基线HBV DNA水平后，LLV相对于MVR的风险比为2.20(1.34～3.60)。该研究表明，恩替卡韦治疗过程中的LLV可增加HCC发病风险，尤其是在患有肝硬化的患者中。该研究团队2015年发表的一篇论文报道了另一项回顾性队列研究，纳入了385例初治、LLV、HBV相关代偿性肝硬化患者，随访观察平均5.6年，发现LLV组患者HCC 5年发生率显著高于HBV DNA阴性组(<12 IU/ml)，分别为10.0%和2.2%，其风险比为5.20(1.53～17.6)[23]。

LLV对HCC的影响不只在于增加发病率，还可导致HCC患者总体生存率下降。上述韩国研究团队2019年报道了另一项回顾性队列研究，描述了伴有LLV的HBV相关HCC患者的临床过程[24]。研究纳入565例伴有慢性乙型肝炎LLV的成年HCC患者，根据病毒学应答情况分为3组，MVR组(持续性HBV DNA<9 IU/ml)、LLV组和反跳组(至少一次HBV DNA>2 000 IU/ml)，随访时长4.1±2.1年。结果显示，MVR组(187例)、LLV组(221例)和反跳组(157例)患者的5年生存率分别为74.3%、67.3%和61.7%，其中LLV组与MVR组患者5年生存率的差别统计学意义较弱(P=0.076)。该研究说明维持MVR有利于提高HCC患者的5年生存率，相对于MVR，LLV不利于HCC患者的5年生存率的改善。

3.3 LLV与慢性乙型肝炎再活动 非活动性慢性乙型肝炎LLV可自发或在一定条件下发生HBV再活动。2019年美国和加拿大开展了一项多中心队列研究，观察了HBeAg阴性慢性乙型肝炎低病毒载量患者(≤10 000 IU/ml)未治疗情况下自发为活动性肝炎的情况[25]。研究纳入951例HBeAg阴性的未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎成年患者，要求HBV DNA≤10 000 IU/ml(包括HBV DNA 1 000～10 000 IU/ml且ALT<1×ULN，HBV DNA<1 000 IU/ml且ALT 1～2×ULN)，并排除失代偿性肝病、肝癌、急性HBV感染等情况。平均随访4年，观察病情变化，作者引入“模式转换”这一概念作为观察指标，定义为非活动性乙型肝炎向活动性乙型肝炎的自发转变，具体标准为HBV DNA>10 000 IU/ml且ALT>2×ULN(ULN的男女数值分别为30 U/L和20 U/L)，或入组24周后启动抗病毒治疗。结果显示，834例DNA DNA≤10 000 IU/ml且ALT≤2×ULN的患者纳入了模式转变分析，共有97例发生了模式转变或启动治疗(7.6/100人年)；按HBV DNA水平进行分组，≤100 IU/ml，101～≤2 000 IU/ml和2001～≤10 000 IU/ml三个组的模式转变或启动治疗发生密度分别为4.6/100人年、6.8/100人年和12.2/100人年，而5年累积发生率分别为9.2%、13.6%和24.2%；单纯模式转变有55例(3.6/100人年)，三个组的发病密度分别为0.8/100人年、3.7/100人年和5.9/100人年，5年累积发生率分别为2.4%、8.3%和13.3%。基线HBV DNA≤2 000 IU/ml的有634例，两组HBV DNA≤100 IU/ml和101～≤2 000 IU/ml的模式转变或启动治疗的5年累计发生率分别为9.7%和15.9%，而单纯模式转换的5年累计发生率分别为3.0%和10.6%。该研究中HBV DNA≤100 IU/ml和101～≤2 000 IU/ml两个组可视为HBeAg阴性慢性乙型肝炎LLV，随访结果显示，其向活动性肝炎自发转换的几率并不低。此类患者应当定期给予HBV DNA和生化等监测，及时发现病情变化并进行恰当干预。2014年的一篇文献报道了来自韩国的一项回顾性队列研究，该研究纳入130例HBV相关的早期HCC患者，所有患者均接受了HCC根治性切除术治疗，其中64例接受抗病毒治疗，且术前HBV DNA<2 000 IU/ml，其中HBV DNA阴性(<9 IU/ml)组53例，LLV组77例，术后随访平均28.3个月，两组患者HBV再激活的发生率分别为41.5%和40.3%，而HBV再激活是HCC术后复发的危险因素，其风险比为2.03(1.06～3.88)，值得注意的是，抗病毒治疗可显著降低术后HBV再激活的发生率[26]。

3.4 LLV与HBV耐药 HBV耐药相关突变在经治及未治疗患者中均少量存在，而抗病毒治疗对HBV耐药相关突变有筛选作用。抗病毒治疗过程中，HBV耐药常表现为病毒学突破。病毒学突破早期发生耐药突变的HBV复制能力一般较为低下，但是，如果不及时调整抗病毒治疗方案，HBV可能继续发生补偿性突变，而使其复制能力逐步恢复[1]。抗病毒治疗过程中出现的LLV可能与HBV发生耐药性突变有关，而持续LLV或可促进HBV耐药的发生，增加病毒学突破的几率。

2010年发表的一项关于HBV耐药的小样本横断面研究，纳入64例拉米夫定或拉米夫定+阿德福韦酯治疗的乙型肝炎患者，其中25例出现病毒学突破，血清HBV DNA浓度为12～345 IU/ml，39例HBV DNA低于检测下限(12 IU/ml)，拉米夫定耐药突变结果表明，22例成功进行检测的病毒学突破患者中，17例(77.2%)为阳性，而HBV DNA<12 IU/ml的患者中12例成功进行了拉米夫定相关耐药突变检测，6例阳性(50%)[27]。由此可见，抗病毒治疗过程中，即使病毒血症水平极低，HBV的耐药突变仍可出现。不过，LLV与HBV耐药发生率的确切关系，持续LLV是否诱发HBV耐药，目前尚待更有针对性和说服力的研究进行阐释。

4 LLV的临床管理

慢性乙型肝炎治疗的病毒学应答通常定义为血清HBV DNA不可测，但此定义依赖于实验室检测方法的检测值下限。当前临床上常用的HBV DNA检测技术的检测值下限有100 IU/ml、20 IU/ml，部分医疗机构甚至仍使用检测值下限为500 IU/ml的检测技术，十分不利于LLV的检出。HBV DNA检测技术发展迅速，部分单位的实验室技术除了可定量检测低至20 IU/ml的HBV DNA，还可以给出“目标未检出”定性结果，而微滴式数字PCR技术的引进可使HBV DNA定量检测下限低至8拷贝/ml，获得临床应用后可进一步助力于检出更多LLV[28]。

慢性乙型肝炎患者接受抗病毒治疗过程中出现LLV，后续应如何处理，目前尚无高质量研究给予指引。AASLD最新慢性乙型肝炎指南建议，接受恩替卡韦、替诺福韦、TAF单药治疗的患者出现持续LLV时，无论ALT是否异常，均可继续原方案单药治疗，但相关研究证据质量很低[1]。有研究显示，恩替卡韦单药治疗和核苷(酸)类似物联合治疗(拉米夫定+阿德福韦酯、拉米夫定+替诺福韦、恩替卡韦+阿德福韦酯、恩替卡韦+替诺福韦)2年及以上仍表现为LLV的43例慢性乙型肝炎患者，换用TAF治疗48周后，其中40例获得了病毒学应答(<20 IU/ml)[9]。因此，抗病毒疗效不理想或出现持续LLV时，换用耐药屏障更高的抗病毒药物不失为一种有效的临床方案。

5 讨论

当前，一线强效低耐药抗病毒药物恩替卡韦、替诺福韦、TAF临床应用日渐广泛，持续病毒应答率显著改善[29]。但临床上LLV问题逐渐凸显，需要引起临床医生足够重视。然而，目前LLV相关研究较少，其临床过程及分子机制尚待进一步阐释。综合现有资料分析，LLV亟待解决的问题有以下几个：①LLV的概念需要进一步澄清，方便临床管理和和研究；②LLV的流行病学，如在未治和经治患者中的发生率，不同性别、年龄中的发生率；③进一步揭示LLV患者的临床表现，比如肝功能异常情况，如何与非活动性HBsAg携带者进行区分等等；④进一步研究LLV的临床意义，比如是否影响HBeAg血清转换率及HBsAg的下降或阴转，是否促进HBV耐药，是否促进肝炎活动、肝纤维化进展和HCC发生，是否不利于乙型肝炎患者远期生存；⑤针对LLV，如何制定更合理的抗病毒初治方案和挽救治疗方案。