发酵法对比提取丹参黄酮研究

李志清 王殿奎 许 岩 李 婷 范桂强 孙金旭

（1 衡水市食品药品检验检测中心 河北 衡水 053000；2 衡水学院 河北 衡水 053000）

丹参(Salvia miltiorrhiza)，临床上主要用于活血化瘀，治疗心血管疾病、糖尿病等，药用价值极高。丹参内的主要化学成分为丹参黄酮、丹参素等物质，和其他中药配伍后，具有缓解失眠、肝损伤、体疲劳等症状的功效[1]。

在微生物发酵过程中会产生多种酶类，如木质素酶、蛋白酶、纤维素酶等，这些酶类能够非常有效的分解植物的细胞壁，扩大细胞的间隙，有利于细胞内物质的溶出，李嘉懿[2]、魏萌[3]分别用乳杆菌和芽孢杆菌发酵中草药，通过发酵工艺的优化，可使多糖含量比发酵前分别提高2.51 倍和1.57 倍，极大的提高了多糖的得率。

丹参中的活性物质提取方法很多，而发酵法提取丹参黄酮的报道较少，本研究对发酵法提取丹参黄酮的过程进行了探讨，以期提高丹参活性物质的提取量。

1 材料与方法

1.1 材料。丹参(购于衡水市医药公司，高纯水清洗干净后，于60 ℃烘干、粉碎，过60 目筛备用)；芦丁标准品(上海如吉生物科技发展有限公司提供)。

1.2 仪器与设备。高速万能粉碎机(江阴市新雄机械制造有限公司生产)；分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司生产)；分光光度计UV-250(日本岛津)；发酵桶(特百惠)。

1.3 黄酮含量测定方法[4]

1.3.1 标准溶液的配制。称取芦丁标准品10 mg，放于100 ml 烧杯中，60%乙醇溶解后用100 ml 容量瓶做定容处理，得到100 mg/L 芦丁标准液。

1.3.2 标准曲线的绘制。用移液枪分别吸取0 ml、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml 芦丁标准液转入比色管中，依次添加5%亚硝酸钠溶液1 ml，摇匀，静置6 min；添加10%硝酸铝1 ml，摇匀，静置6 min；加入4%的氢氧化钠溶液10 ml；用60%的乙醇稀释至刻度线，摇匀后，放入玻璃比色皿中。在510 nm 处测定吸光度，以芦丁标准液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程A=0.0135C-0.051，R2=0.9995。

1.3.3 丹参总黄酮的提取及测定。经提取后的丹参黄酮提取液20 ml，用乙醇溶液(60%)稀释定容至50 ml，按标准液测定方法测定吸光度值。

2 结果与分析

2.1 不同发酵菌种对丹参黄酮提取的影响。不同菌种在发酵过程中的代谢机制不同，所以产生的酶系和产物不同，对丹参发酵黄酮提取的影响不同。分别选取酿酒酵母、木醋杆菌、保加利亚乳杆菌、黑曲霉作为发酵菌种，以普通热水提取为对照，试验不同菌种对发酵提取丹参黄酮的影响效果，结果如图1所示。由图1 可知，和对照相比，不同菌种对发酵提取丹参黄酮均有不同程度的提高。酿酒酵母菌对发酵提取丹参黄酮影响较大，与对照相比，丹参黄酮提取量提高42.07%，其它菌提高较少，最终确定以酿酒酵母菌作为提取丹参黄酮的发酵菌。

图1 发酵菌种对丹参黄酮提取的影响

2.2 料液比例对发酵丹参黄酮提取量的影响。丹参经粉碎后，分别按1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 的料液比进行配制，然后分别煮制，灭菌后，接种量0.8%，发酵1∶25 时，丹参黄酮提取量达到最大，之后随料液比例的增大，丹参黄酮提取量有降低趋势，表明，料液比例为1∶25 时较为适宜。

2.3 接种量对发酵提取丹参黄酮的影响。经粉碎后的丹参，按料液比1∶25 配比后，经煮制、灭菌后，分别按照0.2%、0.5%、0.8%、1.1%、1.4%的接种比例进行接种，发酵16 h 后测定丹参黄酮提取量，结果如图3所示。由图3 可知，接种量对发酵丹参黄酮提取量有一定的影响，随着接种量的增大，丹参黄酮提取量逐渐增加，当接种量达到1.1%时，丹参黄酮提取量达到最大，为33.19 mg/g，之后随接种量增大，丹参黄酮提取量变化不大，因此，接种量设定为1.1%较为适宜。

图3 接种量对发酵丹参黄酮提取的影响

2.4 发酵时间对发酵法提取丹参黄酮的影响。丹参经粉碎后，配置料液比例1∶25，煮制灭菌后，按接种量1.1%接种酵母菌，每4 h 取样测定，研究发酵时间对丹参黄酮提取量的影响，结果如图4所示。由图4可知，随发酵时间的延长，丹参黄酮提取量逐渐增加，当发酵时间达到28 h 时，丹参黄酮提取量达到最大，为33.92 mg/g，因此，发酵提取丹参黄酮，发酵时间28 h 较为适宜。16 h 后，测定丹参黄酮提取量，结果如图2所示。由图2 可知，一定的料液比例对丹参黄酮提取量有一定的影响，随着料液比例的提高，丹参黄酮提取量逐渐提高，当料液比例达到

图2 料液比例对发酵丹参黄酮提取的影响

图4 发酵时间对发酵丹参黄酮提取的影响

3 结论与讨论

发酵法提取丹参黄酮研究中，通过对发酵菌种的选择，料液比例的确定，菌种接种量、发酵时间的确定，最终确定发酵提取丹参黄酮研究中的工艺参数如下：发酵菌种选择酵母菌，料液比例确定为1∶25，接种量为1.1%，发酵时间28 h，此条件下丹参黄酮提取量达到33.92 mg/g，和普通热浸提相比(21.25 mg/g)，丹参黄酮提取量相对提高59.62%，表明发酵法提取丹参黄酮相对于普通热浸提是非常行之有效的。利用微生物对中药成分进行发酵转化，能够有效的提高丹参中的活性成分，并在微生物酶的作用下，转化产生新的活性成分，并可减轻毒副作用[4]。具体转化机理有待于进一步研究。