联合多种检测方法应用于产前诊断的结果分析

魏顺娣，娄季武，谢润桂

（东莞市妇幼保健院产前中心 广东 东莞 523002）

9 号染色体携带许多基因，嵌合型9-三体胎儿临床特征常表现为生长发育迟缓、智力缺陷及面部、大脑、心脏、肾脏和骨骼异常等[1]随着临床检验技术的不断发展，对于染色体异常的检测方法也越来越多，本文联合应用多态性微阵列基因芯片、无创产前筛查技术（NIPT）、细胞核型结合超声对3 例9 三体嵌合染色体进行产前诊断。

1.资料与方法

1.1 一般资料

例1 孕妇32 岁因在外院做NIPT 提示9 号染色体短臂异常于22+周在我院进行产前诊断；例2 孕妇44 岁，因在外院做NIPT 提示9 号染色体异常于孕18+周在我院进行产前诊断；例3 孕妇42 岁，因B 超示胎儿单脐动脉于孕17 周在我院进行产前诊断。3 对夫妻均为非近亲结婚，均否认家族遗传病、药物过敏史及孕期有毒物质接触史。所有检查均征得了患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 染色体G 显带分析 在B 超引导下将穿刺获得的25 mL 羊水，弃前段抽取的2 mL，用无菌管分装，离心取0.5 mL 的沉淀物加培养液进行培养7 d 后换液，2 d 后再观察培养瓶中细胞生长情况，细胞克隆达到15个以上后开始收获。经吉姆萨染色制片后计数30 ～50个分散良好的中期分裂相，并分析5 个核型。根据《全国染色体病与医学细胞遗传学实验室工作手册》进行定带命名。

1.2.2 NIPT 检测 需取孕妇静脉血约5 mL 于抗凝管中，离心分离血浆提取cfDNA，-20℃保存待测。根据晶芯胎儿染色体非整倍体检测试剂盒，使用晶芯Bioelectron Seq 4000 系统测序仪进行测序，测序读数与人类参考基因组比对，计算出胎儿染色体非整倍体异常风险率，并对结果进行随访，NIPT 检测高风险孕妇应行羊水穿刺作最终诊断。

1.2.3 染色体微阵列分析 取羊水10 mL 离心后，取沉淀用于基因组DNA 提取。染色体微阵列分析采用美国Affymatrix 公司的CytoScan 750K 芯片，按照说明书依次进行酶切、连接、PCR 扩增/纯化、片段化、标记、杂交、洗染、扫描等实验操作，扫描得到的数据使用ChAS 4.0软件进行数据转换分析，获得染色体拷贝数变异数据，拷贝数变异的致病性片段根据ACMG 指南进行[2]，结合OMIM、UCSC、ISCA、DGV、DECIPHER2 等数据库，获得最终结果。

2.结果

2.1 染色体G 显带分析结果

3 例胎儿羊水染色体G 显带分析结果分别：例1 细胞核型47，XX,+mar[2]/46，XX[38],其中的mar 单从G 显带结果难以判断其来源和大小；例2 细胞核型为47,XX,+9[6]/46，XX[34]，9-三体嵌合比例为15%；例3 细胞核型为47，XX,+9[20]/46，XX[80]，嵌合比例为20%，见图1～3。

图1 核型结果：47, XX,+mar[2]/46, XX[38]

图2 核型结果：47, XX,+9[6]/46, XX[34]

图3 核型结果：47, XX,+9[20]/46, XX[80]

2.2 NIPT

3 例胎儿羊水染色中，有2 例NIPT 提示异常：例1孕妇提示9 号染色体短臂重复异常；例2 孕妇因高龄行无创产前筛查提示9 号染色体数目异常。

2.3 染色体微阵列分析

3 例胎儿羊水染色体微阵列分析结果中，例1 的染色体微阵列结果为arr[GRCh37] 9p24.3p13.1（208455-38787480）x2-3，提示胎儿为9 号染色体的断臂区域存在嵌合性重复，嵌合比例约10%。例2 的染色体微阵列结果为arr[GRCh37] 9q21.11q21.32（71013799-85812330）h m z；a r r[G R C h37] 9q21.11q21.32（101625875-133367368）hmz arr（9）x2-3，提示胎儿9 号染色体9q21.11q21.32 区域存在大片段纯合子现象，且9 号存在低比例嵌合重复，比例约15%。例3 的染色体微阵列结果为arr[GRCh37] 9p24.3q34.3（208454-141018648）x2-3，提示胎儿为9 号染色体的三体嵌合体重复比例约50%，见图4 ～6。

图4 CMA 结果

图5 CMA 结果

图6 CMA 结果

3.讨论

染色体异常包括数目畸变和结构畸变，染色体异常是胎儿出生缺陷和死亡的重要原因，对生长发育影响大，异常染色体比例越高，胎儿预后越差。9-三体是非常罕见的，其临床特征常表现为生长发育迟缓、智力缺陷、心脏异常，常在婴儿期死亡，临床建议孕妇终止妊娠。大量研究证实，三体中额外的1 条染色体90%来源于母亲，多是由于卵母细胞在第1 次减数分裂时发生错误而形成[3]。本文病例中有2 例孕妇为高龄母亲，高龄妊娠是导致三体妊娠发生的高危因素，主要因为高龄母亲的卵子会发生老化，有报道显示35 岁以上的女性发生染色体非整倍体异常的风险明显高于低于35 岁的女性[4]。

嵌合体由2 种或2 种以上不同核型的细胞组成，具有不同核型的细胞如来源于同一个合子称为嵌合体[5]，可以是染色体数目之间、染色体结构之间以及染色体数目和结构之间的嵌合，羊水细胞嵌合存在真嵌合和假嵌合，胎儿嵌合体形原因有：（1）胎儿自身为真性嵌合体"即在合子形成后的卵裂过程中或胚胎发育早期发生体细胞突变而形成嵌合体该嵌合体可以涉及任何一条染色体畸变"形成各种染色体数目和结构畸变的嵌合体；（2）在羊膜腔穿刺的过程中，可能通过穿刺针带入微量的母体细胞培养过程中母体细胞与胎儿细胞并存增殖；（3）非胚胎细胞增殖；（4）胎儿细胞离体培养或制片过程中因为外界环境改变和外力作用使染色体发生断裂重接、丢失或增加[6]。对于低比例嵌合或嵌合细胞受累组织少，都应进行多种方法同时检测，使用单一方法，对嵌合型三体的均可发生漏诊。

染色体数目异常和大片段的不平衡重复均能用传统的染色体核型分析与CMA 检测。虽然传统核型分析是产前细胞遗传学诊断的金标准，但对染色体微缺失（低于5 Mb）是无法检测，低比例的嵌合也存在一定的误差，尤其对衍生染色体不能完全标出它的来源。CMA 在检测染色体微缺失和微重复方面较传统核型分析具有更高的灵敏度和特异性，结果真实性高，可明确标出染色体的来源，检测时无需进行羊水培养，可用于任何组织和细胞的检测，报告周期短，可减轻患者的焦虑，其劣势在于无法检出染色体平衡易位、平衡倒位以及低比例的嵌合。超声软指标近年应用在孕期胎儿染色体异常筛查在，但其灵敏度不高，并不能作为一项独立指证。NIPT 近年广泛应用到临床中，已成为筛查胎儿缺陷的一种重要手段，对于胎儿染色体异常筛查检测的准确率较高且安全性高，可避免羊水穿刺，但其结果只作为筛查结果，并不能用作确诊结果，如在孕中期行NIPT 检测提示结果异常，均建议孕妇必须进一步行羊水核型分析以及CMA 的检测。

综上所述，在产前诊断中联合运用NIPT、染色体核型分析与CMA 检测，结合胎儿形态进行细致的超声评估能更好地提高胎儿染色体异常的检出率，为产前诊断提供更全面准确的遗传咨询，有效降低出生缺陷的发生率。