雷帕霉素对DDC 诱导小鼠原发性硬化性胆管炎的治疗效果研究

周倩扬杨慧敏李 静徐 娜刘继鑫张蓓蓓于 倩郑葵阳颜 超*

(1.徐州医科大学病原生物学与免疫学教研室,江苏徐州 221004;2.江苏省免疫与代谢重点实验室,江苏徐州 221004)

原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis,PSC)是一种慢性胆汁淤积性肝病,其主要表现为胆管周围炎症和纤维化,可造成胆管阻塞、肝硬化、肝衰竭甚至胆管癌[1-3]。 遗传、环境、机体免疫等因素均可导致PSC 的发生,但PSC 的致病机制尚不完全清楚,目前尚无有效的治疗药物[4]。因此,寻找一种有效改善或治疗PSC 的药物,迫在眉睫。

DDC(3,5-diethoxycarbonyl L 1,4-dihydrocollidine,DDC)是一种异源性毒物,小鼠经喂饲DDC 后,可致胆管内栓塞,最终形成胆管阻塞型胆汁淤积性肝损伤,其在临床表现和发病机制上与PSC 有诸多的相似之处,因此DDC 诱导的小鼠胆管损伤是研究PSC 致病机制和相关药物研发较为理想的动物模型[5]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of Rapamycin,mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,在体内有mTORC1 和mTORC2 两种功能不同的复合体,广泛参与细胞的增殖、生长和自噬等生物学过程,雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)是一种有效且特异性的mTORC 抑制剂[6]。 有研究表明,雷帕霉素可减轻ConA 诱导的肝细胞坏死、炎细胞浸润及肝纤维化[7]。 因此,本研究拟研究雷帕霉素对DDC 饮食诱导的胆管损伤是否具有治疗作用,并探讨其潜在的作用机制,为临床治疗原发性硬化性胆管炎提供潜在药物。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级C57BL/6 雌性小鼠15 只,6~8 周,体重18~25 g,购自浙江维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(浙)2019-0001],饲养于清洁级动物房,自由摄食和饮水,腹腔注射等操作在徐州医科大学实验动物中心屏障动物实验操作间[SYXK(苏)2016-0028]进行,实验动物使用、操作许可由徐州医科大学实验动物伦理委员会批准通过(IACUC:(201801w003)),动物护理和本研究的所有实验都遵循国家实验室动物中心和徐州医科大学实验动物中心的指导方针,并按实验动物使用的3R 原则给予人道关怀。

1.2 主要试剂与仪器

DDC(STBJ2468,纯度99%,美国 Sigma 公司);雷帕霉素(上海碧云天公司); TRIzol (美国Invitrogen 公司); 引物由上海捷瑞公司合成;FastKing 一步法除基因组cDNA 第一链合成试剂盒(北京天根生化科技有限公司);实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)荧光Mix(北京TransGen Biotech公司);兔抗小鼠 CK19,Ki67 抗体(美国 Abcam 公司); 兔 抗 小 鼠 mTOR, P-mTOR, AKT, P-AKT(Ser473)单克隆抗体(杭州华安生物技术有限公司);兔抗小鼠p65,P-p65 单克隆抗体(美国,Cell Signaling Technology 公司);兔抗小鼠 GAPDH 单克隆抗体、山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗(武汉ABclonal公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组与模型的建立

8 周龄清洁级雌性C57BL/6J 小鼠平均体重20 g 左右,随机分为单独 DDC 饮食组、DDC 造模+雷帕霉素(RAPA)治疗组,每组5 只小鼠。 治疗组每天腹腔注射一次雷帕霉素(根据说明书,用DMSO 溶药,用生理盐水稀释至1 mg/mL,注射剂量为5 mg/kg 小鼠体重),两组均连续注射一周,此期间每天对照组腹腔注射0.1%二甲基亚砜(DMSO),最后一次注射 RAPA 后 24 h 进行取材及相关的检测,见图1a。

1.3.2 HE 染色

小鼠肝组织于4%中性甲醛中固定约48 h 后经脱水、石蜡包埋制成组织石蜡切片,行苏木素& 伊红(HE)及Masson 染色,于光学显微镜下观察病变情况,对HE 染色结果图进行病理学评分[8],Masson染色结果图用Image J 进行定量分析。

1.3.3 免疫组化

微波处理(0.01 mmol/L 柠檬酸盐缓冲液,pH6.0)石蜡切片(4 μm),用5% BSA 室温封闭样本组织30 min,使用单克隆小鼠抗 CK19、Ki67 抗体(稀释 1 ∶100;Abcam),对照组滴加 1% BSA,置于湿盒中4℃过夜。 于第2 天取出玻片,滴加预先按说明书稀释的二抗,将玻片置于湿盒中,放于37℃温箱静置30 min。 配制DAB 显色液,滴加于切片组织上,镜下观察显色变化。 于玻片上滴加苏木素染色剂覆盖组织,室温静置5~10 s,流水冲洗干净,脱水封片。 于光学显微镜下观察阳性分布情况,并用Image J 定量分析。

1.3.4 qPCR 检测Il6、Tnfa、Il1b、Timp1、Tgfb和Col1 的 mRNA 表达水平

用TRIzol 法按说明书步骤提取各组肝组织的总RNA,将 RNA 逆转录成 cDNA 后进行PCR 扩增反应。 以Gapdh作为内参,目的基因mRNA 表达量用 2-ΔΔCt计算,引物序列见表 1。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers used in the study

1.3.5 Western blot

提取各组细胞总蛋白,用BCA 法测浓度,每孔取60 μg 蛋白样品上样进行 SDS-PAGE 电泳,用BioRad 标准转膜装置进行湿式转膜,5%脱脂牛奶室温封闭 2 h,分别加入 mTOR、P-mTOR、AKT、PAKT(Ser473)、p65 或 P-p65 一抗 4℃冰箱摇床孵育过夜,洗膜,二抗孵育1.5 h,加ECL 显影液曝光显影,用Image Lab 软件分析结果,将目的蛋白灰度值/对应内参蛋白灰度值的比值作统计学分析,实验重复4 次。

1.4 统计学方法

实验数据经SPSS 19.0 统计软件分析处理,呈正态分布的计量资料以平均数±标准差()表示,两组间数据比较用独立样本t检验,多组均数间的比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,以P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RAPA 可改善DDC 饮食诱导的小鼠肝内胆管病理学特征

通过HE 染色和Masson 染色可见,正常组小鼠肝未见明显异常(图 1b、1c)。 DDC 组小鼠胆管周围见及明显炎性细胞浸润,大量胶原纤维沉积,胆管异常增生,结构紊乱;而RAPA 治疗组小鼠胆管周围炎性细胞浸润、胶原纤维沉积现象显著减轻,胆管增生有所缓解。 通过定量分析进一步显示,与DDC 组相比,RAPA 治疗组小鼠炎症病理评分明显降低(图1d,P< 0.05),纤维沉积减少(图1e,P<0.01),差异有统计学意义。

图1 小鼠肝组织病理学变化Note. a, Modeling schematic diagram. b, HE staining. c, Masson staining of mice liver of each group. d, HE staining pathological score. e, Quantitative analysis of Masson staining (n = 4). Compared to the corresponding group,*P< 0.05,**P< 0.01,****P< 0.0001.Figure 1 Pathological changes in liver tissue in mice

2.2 RAPA 可抑制DDC 诱导的小鼠肝中胆管上皮细胞的增生

为了进一步证实RAPA 抑制DDC 诱导的胆管上皮细胞增生情况,我们通过免疫组织化学染色检测了胆管增生相关标志物CK19、Ki67 的表达。 如图2 所示,与正常小鼠相比,DDC 饮食组小鼠肝CK19(图 2a 和 2b;P< 0.01)、Ki67(图 2c 和 2d;P<0.0001)的阳性分布区域明显增多。 而RAPA 处理后,CK19 阳性区域(P<0.01)和Ki67 阳性区域(P<0.001)明显降低,因此,RAPA 可显著抑制DDC 诱导的胆管损伤。

图2 DDC 饮食导致各组小鼠肝中CK19、Ki67 的表达变化Note. a-b,Positive distribution of CK19 and Ki67 in the livers of each group of mice. c-d,Quantitative analysis of CK19 and Ki67 expression(n=4).Compared to the corresponding group,****P< 0.0001,***P< 0.001,**P< 0.01,*P< 0.05.Figure 2 The DDC diet resulted in changes in expression of CK19 and Ki67 in the livers of each group of mice

2.3 RAPA 可降低DDC 饮食诱导小鼠肝炎症和纤维化相关因子的水平

我们进一步采用qRT-PCR 检测了炎症(Il6、Tnfa和Il1b)和纤维化(Timp1、Tgfb和Col1)相关因子的基因水平。 与正常小鼠相比,DDC 组中小鼠肝组织中Il6(图 3a,P< 0.0001)、Tnfa(图 3b,P<0.01)、Il1b(图 3c,P< 0.001)及Timp1(图 3d,P<0.0001 )、Tgfb(图 3e,P< 0.0001)和Col1(图 3f,P<0.0001)mRNA 相对表达水平均明显升高,说明DDC 饮食可引起小鼠肝炎症和纤维化,分别与结果1 HE 染色中炎性细胞浸润和Masson 染色中纤维沉积的病理结果相一致。 而在RAPA 干预后,这些炎症和纤维化相关因子的mRNA 表达水平均明显降低(图3a~3d,P<0.01),说明 RAPA 能减轻 DDC 引起的小鼠肝炎症和纤维化。

2.4 RAPA 可能通过调控 Akt/mTOR/ NF-κB 信号通路抑制DDC 诱导的胆管损伤

为了进一步探讨RAPA 抑制DDC 诱导的胆管损伤的分子机制,由于 RAPA 作为 mTOR 的抑制剂,与正常小鼠相比,给与RAPA 之后总的mTOR不会发生改变,而磷酸化的mTOR(P-mTOR)表达降低,这一现象已有文献报道[9],而且单纯给与RAPA并不会激活p65 和P-p65[10],因此我们进一步通过Western blot 检测 DDC 组和 DDC+RAPA 组小鼠肝mTOR、P-mTOR、AKT、P-AKT(Ser473)、p65 和 P-p65 活化情况。 结果显示,与 DDC 组小鼠相比RAPA 干预后,P-AKT(Ser473)、P-mTOR 和 P-p65(图4a)活化水平明显降低,差异具有统计学意义(图 4b~4d,P< 0.05)。 上述结果提示:RAPA 可能通过调控Akt/mTOR/ NF-κB 信号通路改善DDC 诱导的原发性硬化性胆管炎。

图4 小鼠肝组织中mTOR、P-mTOR、AKT、P-AKT(Ser473)、p65 和 P-p65 蛋白表达变化Note. a, Expression of AKT, P-AKT (Ser473), mTOR, P-mTOR, p65 and P-p65 in liver of mice in each group was detected by Western blot. b-d, Quantitative analysis of protein expression(n=4). Compared to the corresponding group, **P< 0.01,*P< 0.05.Figure 4 Changes in protein expression in mTOR, P-mTOR,AKT, P-AKT(Ser473), p65 and P-p65 in mice liver

3 讨论

原发性硬化性胆管炎是一种罕见的慢性胆汁淤积性肝病,其特征是肝内或肝外胆管狭窄或两者兼有,并伴有胆周炎症和胆管纤维化。 胆管和肝的炎症和纤维化会继之发展为胆汁生成或循环障碍,以及进行性肝功能障碍[11-12]。 DDC 饮食诱导的小鼠肝损伤模型是一种经典的进行性胆汁淤积性肝损伤模型,研究显示该模型导致的小鼠胆汁淤积性肝损伤,在发病机制和临床表现上均可模拟人类原发性硬化性胆管炎[13]。 有研究报道,DDC 饮食一周的小鼠,其肝即出现明显的胆管反应(ductal reaction, DR),表现为胆管上皮样增生并伴有炎症细胞浸润,随着DDC 的持续作用,肝中出现大量炎症细胞浸润和成纤维母细胞活化,逐渐形成洋葱皮样胆管损伤[14-16]。

本研究成功构建了DDC 诱导胆汁淤积性胆管损伤动物模型,并深入揭示雷帕霉素对胆汁淤积性胆管损伤的作用及分子作用机制。 本研究利用了HE 染色及Masson 染色法详细观察了各组小鼠肝病理变化情况,结果显示模型组小鼠肝胆管周有炎性细胞浸润和胆管增生,并伴随有胶原纤维的沉积,这与Jansen 等[17]的结果相一致。 而RAPA 治疗组胆管周炎性细胞的浸润明显减少,胶原纤维沉积现象明显减轻。 证实RAPA 可以减轻DDC 诱导的小鼠肝炎性浸润,胆管增生和纤维化。 细胞角蛋白(CK19)不存在于成体肝细胞中而主要存在于肝祖细胞和胆管上皮细胞(BECs)中,是最广泛使用的胆管细胞和肝祖细胞标记物[18],也是胆管反应标志物[19],Ki67 表达于活跃分裂的细胞核中[20],是细胞增殖的标志物[19-21],我们的结果显示,RAPA 治疗可以显著下调 DDC 饮食引起的CK19 和Ki67 的高表达,表明RAPA 可以抑制胆管上皮细胞的增殖。已有的报道及我们的结果(图1b~1c)均显示DDC饮食可诱导肝汇管区周围炎症细胞的浸润和胶原沉积[22],故在本研究中,我们运用qRT-PCR 进行进一步验证和补充,分析了相关炎性细胞因子Il6、Tnfa和Il1b的表达,RAPA 处理后可以明显降低这些促炎细胞因子的水平,肝纤维化相关指标Timp1、Tgfb和Col1 是小鼠进行性胆管纤维蛋白基因,可在一定程度上反映纤维化的发展[14],在RAPA 处理后也被抑制。 已有文献研究表明,肝炎症反应能促进肝纤维化的发生、发展[1-2],本研究发现在DDC 喂食小鼠后,其肝中NF-κB p65 磷酸化水平及其下游炎症因子明显升高,且纤维化化程度明显加重,而经RAPA 治疗后,NF-κB p65 磷酸化水平降低且炎症因子表达水平明显降低,并伴随肝纤维化程度得到也明显改善,这些结果显示 RAPA 可能通过抑制肝胆管炎症来改善DDC 诱导的胆汁淤积性肝纤维化,但具体机制还仍需要进一步探讨。

图 3 DDC 饮食诱导小鼠肝中 Il6、 Tnfa、Il1b、Timp1、Tgfb 和 Col1 的 mRNA 表达变化Note. a-f, Relative expression of Il6, Tnfa, Il1b, Timp1, Tgfb and Col1 in liver tissues of mice in each group was detected by qRT-PCR,respectively(n=4). Compared to the corresponding group,****P< 0.0001,***P< 0.001,**P< 0.01,*P< 0.05.Figure 3 The DDC diet induced changes in mRNA expressionin the mice livers of Il6, Tnfa, Il1b, Timp1, Tgfb and Col1

NF-κB 被认为是典型的促炎信号转导途径,p65作为NF-κB 最常见的亚基组成形式,被磷酸化修饰后被转运到细胞核内促进促炎基因的表达,包括细胞因子,趋化因子和粘附分子[23]。 过度活化的p65可促进效应分子(如炎症因子)产生,导致炎症性疾病的发生、发展,因此,NF-κB p65 信号通路已经成为药物研发的关键点[10]。 研究表明戊酸(EA)对LPS 诱导的RAW264.7 细胞具有抗炎作用,并且可以通过抑制PI3K/Akt/mTOR/NF-κB 信号通路并抑制LPS 诱导的炎性介质产生[24]。 还有研究表明TIPE2 通过调节 Akt/mTOR /NF-κB 信号轴促进人肺癌细胞的增殖,存活,侵袭和迁移[25]。 这些研究都证实了Akt/mTOR/NF-κB 信号通路在炎症和增生的发生发展中都起着关键作用,已知mTOR 和NF-κB 都是 Akt 的下游效应子,通过 Akt 进行的信号传递可能会通过mTOR 或NF-κB 在两个互斥和独立的方向上进行,mTOR 可通过反馈机制调节Akt,还可以通过mTOR 相关蛋白受体调节Akt 来帮助 mTOR 调节 NF-κB[26]。 本研究结果显示,在给与RAPA 治疗后,P-mTOR、P-Akt、NF-κB P-p65 的磷酸化水平降低,而总的 mTOR、Akt、NF-κB p65 未见明显变化,说明RAPA 作为mTOR 的抑制剂能有效抑制DDC 激活的Akt/mTOR/NF-κB 信号通路的磷酸化水平,从而改善由DDC 诱导的胆管周围炎症,进而改善胆管损伤。

综上,我们研究了RAPA 在DDC 诱导的小鼠原发性硬化性胆管炎作用,结果显示RAPA 可改善DDC 饮食诱导的小鼠胆管损伤和炎症反应。 本研究发现RAPA 可能通过抑制 Akt/mTOR /NF-κB 信号通路从而抑制炎性介质的产生,进而改善DDC 诱导的小鼠胆管损伤。 因此RAPA 有望成为治疗胆汁淤积性胆管损伤的有效药物,本研究结果将为PSC 患者临床治疗靶点和新型药物的研发提供一定的实验基础。