TRPM8 参与薄荷醇对炎症因子负调控作用的机制

余 煊杜力军秦 川*

(1.中国医学科学院医学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,卫健委人类疾病比较医学重点实验室,北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心,北京 100021;2.清华大学蛋白质科学教育部重点实验室,生命科学学院医学院药物药理实验室,北京 100084)

薄荷(Mentha haplocalyx Briq),作为重要的药用植物,在我国种植和使用历史源远流长。 其命名有“菝葀”(扬雄·甘泉赋),“茇艹舌”(吕沉·字林),“番荷”(孙思邈·千金方),“菝兰”(陈士良·食性本草),直至李时珍的本草纲目中才称作“簿荷”[1]。薄荷在欧洲医学和西方医学的推广使用则要到18世纪后。 薄荷醇(menthol),也称为薄荷脑,是一种环类单萜,主要存在于薄荷属草本植物,被用于胃肠道[2-3]、呼吸道[4]、泌尿生殖系统[5]炎症的治疗。薄荷醇与薄荷酮、异薄荷酮、一起赋予薄荷属植物新鲜和清凉的气味。 薄荷醇有4 对光学异构体,其中(-)-薄荷醇从薄荷草药中分离出来,拥有清新的薄荷味和多种药理学活性,包括镇咳[6]、镇痛[7]、止痒[8]、抗菌[9]、抗炎[10-12]、抗肿瘤[13-14]等(图 1)。

瞬时受体电位 TRPM8 ( transient receptor potential melastatin-related 8),又称冷和薄荷醇诱导受体CMR-1(cold and menthol induced receptor-1),属于瞬时受体电位(transient receptor potential,TRP)家族[15-16]。 TRPM8 是一个具有六次跨膜结构域的非选择性阳离子通道,N 末端和C 末端位于胞内(图1),可以被冷和具有冷属性的化合物激活,如薄荷醇、Icilin、桉树油等[17-20]。

图1 薄荷醇和TRPM8Note. N, Amino terminal. C, Carboxyl terminal.Figure 1 Menthol and TRPM8

炎症反应是一个复杂的生物学过程,当机体暴露于感染性病原体,或遭遇物理或化学损伤时发生的一种防御反应。 神经系统炎症会影响神经系统的功能,强迫症[21]、阿尔兹海默症[22]、中风[23]、创伤性脑损伤[24]等疾病都伴随神经系统的慢性炎症。目前有多个研究工作,通过小鼠模型或细胞模型表明薄荷醇对炎症反应的一直与TRPM8 受体相关。Ramachandran 等[25]发现,在小鼠结肠炎模型中,薄荷醇和Icilin(TRPM8 激动剂)对小鼠结肠炎症反应有缓解作用。 Juergens 等[26]发现 L-薄荷醇在体外可以显著抑制单核细胞产生PGE、LTB,IL-1β 等炎症因子的释放。 除了薄荷醇,其他一些可以激活TRPM8 受体的因素,如低温[27]、Icilin[28]、桉树油[29]等,据研究报道也对炎症反应具有抑制作用。 本研究工作通过小鼠模型和细胞模型,主要探讨了薄荷醇对神经系统炎症的抑制作用及其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

本实验使用SPF 级ICR 雄性8 周龄小鼠购自华阜康公司[SCXK(京)2019-0008],体重约22 g,共24 只。 实验小鼠饲养于中国医学科学院医学实验动物研究所小鼠SPF 屏障设施[SYXK(京)2018-0019],恒温恒湿,12 h/12 h 固定明暗周期,提供充足的无菌饮水、垫料和食物。 本研究工作中涉及的动物实验内容和所需动物数量通过中国医学科学院医学实验动物研究所伦理审查委员会的审批(IACUC QC18002),并按实验动物使用的3R 原则给予人道的关怀。

1.1.2 实验细胞

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12 细胞),购自ATCC。

1.2 主要试剂与仪器

(-)-薄荷醇(63660-1G)和DMSO 购自Sigma Aldrich(美国);ECL 底物检测试剂盒(10095983)和蛋白质 Marker 购自 Thermo-Scientific;0.9% NaCl、PBS 和钙离子荧光探针Fluo-3AM、RIPA 蛋白裂解液(P0013B)、BCA 蛋白浓度测定试剂盒(增强型P0010)、蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE 预混液、蛋白电泳液、半干转电转缓冲液、TBST、封闭液购自碧云天生物技术有限公司;动物组织总RNA 提取试剂盒(DP451)购自天根生化有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物和细胞分组

24 只小鼠,随机分为对照组(C),溶媒对照组(VC,含0.1% DMSO 生理盐水),薄荷醇高剂量组(50 mg/kg)和薄荷醇低剂量组(10 mg/kg),通过尾静脉注射方式进行给药。 90 min 后,颈椎脱臼处死小鼠,解剖取材获得小鼠脑组织,分离下丘脑核团部分,液氮速冷后-80℃低温保存。

PC12 细胞分为空白对照组、薄荷醇给药组(低剂量200 nmol/L 和高剂量500 nmol/L)。 给药3 h后,收集细胞,进行RNA 和蛋白抽提。

1.3.2 钙成像实验

钙离子荧光探针Fluo-3AM(5 mmol/L)以PBS稀释至1 μmol/L 工作液。 细胞培养皿吸尽培养基后,用无菌 PBS 清洗3 次,清除残留血清后,加入Fluo-3AM 工作液于37℃避光孵育15 min,然后用无菌PBS 清洗 3 遍。 用激光共聚焦显微镜(Leica SP8)选取合适的视野进行拍照。 所得图片结果,进行荧光强度统计分析。

1.3.3 荧光实时定量PCR

动物组织总RNA 提取试剂盒提取小鼠脑组织样本和PC12 细胞样本的总RNA,NanoDrop 分光光度检测所提RNA 浓度和纯度。 FastKing 一步法反转录-荧光定量试剂盒(SYBR Green) (天根,FP313)进行逆转录PCR 和荧光实时定量PCR。 反应体系为:①2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green) 25 μL,②25×RT-PCR Enzyme Mix 2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各 1.25 μL,③RNase-Free ddH2O 将总体系补齐至50 μL。 反应步骤:①逆转录,50℃,30 min;②预变性,95℃,3 min;③PCR 扩增,95℃,15 s → 60℃,30 s,40 个循环;④溶解曲线分析。 引物序列如表1 所示。

表1 Real-time PCR 引物设计Table 1 Primers for Real-time PCR

1.3.4 免疫荧光标记

将处于生长对数期的PC12 细胞接种至24 孔板(密度约为15%),分为对照组和薄荷醇高剂量组(500 nmol/L),细胞贴壁生长至40%左右时进行给药处理。 药物处理后的细胞以4%多聚甲醛固定液室温固定,随后加入0.1%的TritionTM-X-100 通透。以1%的BSA 进行封闭,随后加入目标基因一抗和二抗孵育,二抗孵育时注意避光。 荧光标记后的细胞,置于激光共聚焦显微镜下观察、拍照。 所得结果可进行荧光强度统计分析。 进行免疫荧光双标记时,按如下顺序进行:表达量较低的蛋白一抗→二抗孵育→二次封闭→表达量较高的蛋白一抗→二抗孵育。

1.3.5 蛋白免疫印记

使用RIPA 蛋白裂解液进行组织或细胞样本的蛋白质抽提,使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定。 免疫荧光和蛋白免疫印迹中使用的抗体见表2。

表2 免疫荧光和蛋白免疫印迹抗体Table 2 Antibodies for Western blot and IF

1.4 统计学方法

本研究数据使用SPSS 22.0 软件进行统计分析,所有数值以平均数±标准差()表示。 所得数据符合正态分布时,对组内前后差异比较采用配对样本t检验,组间差异比较采用独立样本t检验。*P<0.05 为差异有统计学意义,**P<0.01 为差异有显著统计学意义,***P<0.001 为差异有极显著统计学意义。

2 结果

2.1 薄荷醇对小鼠下丘脑中TRPM8 蛋白表达的调控作用

下丘脑(hypothalamus)属于机体的中枢神经系统,分布于下丘脑不同区域的神经元通过对温度、渗透压、血糖等因子的敏感,参与体温调节、摄食饮水、内分泌、情绪反应等众多生理活动。 分布于外周神经系统的TRPM8 是机体的温度感受器,对冷和薄荷醇敏感。 我们通过体内实验,检测位于中枢神经系统的TRPM8 是否对薄荷醇敏感。

如图2 所示,ICR 小鼠经尾静脉注射薄荷醇3 h后,通过蛋白免疫印迹检测小鼠下丘脑中瞬时受体电位TRPM8、核转录因子NF-κB 和炎症因子TNF-α表达的变化。 结果显示,相比对照组,薄荷醇高剂量(50 mg/kg)和低剂量(10 mg/kg)组小鼠下丘脑中TRPM8 蛋白的表达显著上调(P<0.01),NF-κB和TNF-α 蛋白的表达显著下调(P<0.01)。

图2 注射薄荷醇小鼠蛋白表达情况Note. C, Control group. VC, Vehicle control group. Compared with control group,**P<0.01.Figure 2 Protein expression of mice injected with menthol

2.2 PC12 细胞对薄荷醇的响应

高度分化的PC12 细胞是具有神经元生物特性的神经元样细胞,被广泛用于神经毒性、神经保护、神经分泌、神经炎症和突触损伤等多个领域的研究工作,是神经生物学体外实验中理想的细胞模型[30-32]。 微 管 相 关 蛋 白 (microtubule-associated protein-2)是神经元细胞的骨架蛋白,参与神经系统发育、形成和再生等重要生物过程[33]。 如图3A 所示,在PC12 细胞中进行神经元标志物MAP2 的原位表达,结果显示,本研究工作中使用的PC12 已经分化为具有神经元特性的细胞。

随后,通过钙成像技术,我们在检测薄荷醇对PC12 细胞的作用。 Fluo-3 AM 是常用的钙离子荧光探针之一,游离形式的Fluo3 不具有荧光特性,与细胞中的钙离子结合后会产生较强的荧光。 如图3B 所示,在 488 nm 激发光下,薄荷醇(200 nmol/L)在PC12 细胞中引发强烈的钙内流反应。通过平均荧光强度分析显示,相比对照组(MFI:61.07± 5.01),薄荷醇组的平均荧光强度为(158.29±14.07),与对照组相比具有极显著差异(P< 0.001)。 上述结果表明,具有神经元属性的PC12 细胞可以很好的模拟小鼠下丘脑中神经元细胞对薄荷醇的响应。

图3 薄荷醇处理PC12 细胞Note. Compared with control group,***P<0.001. Menthol concentration, 200 nmol/L.Figure 3 PC12 cells with menthol

2.3 薄荷醇对PC12 细胞中TRPM8 表达的调控作用

通过荧光实时定量PCR,在mRNA 水平检测薄荷醇对 PC12 细胞中 TPRM8、NF-κB 和 TNF-α 表达的变化。 结果如图4A~4C 所示,200 nmol/L 和500 nmol/L 的薄荷醇均可以促进TRPM8 的表达,同时下调 NF-κB 和 TNF-α 的转录水平。 薄荷醇在转录水平对 TRPM8,NF-κB 和 TNF-α 表达的调控作用呈现剂量相关性。

借助免疫荧光双标记实验,分别使用FITC(绿色)标记细胞中的TRPM8 蛋白,Alex649 (红色)标记细胞中的TNF-α 蛋白,结果如图4D~4E 显示,相比对照组,给药组(薄荷醇 500 nmol/L)中TRPM8(绿色)的平均荧光强度显著升高,TNF-α(红色)的平均荧光强度下降。 以上结果表明,在mRNA 和蛋白水平,薄荷醇对TRPM8 的表达具有激活作用,对TNF-α 的表达具有抑制作用。

图4 薄荷醇对基因表达的影响Note. D/E, Menthol concentration, 500 nmol/L. Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01.Figure 4 Effect of menthol on the gene expression

2.4 薄荷醇对 PC12 细胞(TRPM8 敲低)中相关基因表达的调控作用

为了进一步验证TRPM8 蛋白与TNF-α 的负相关性,我们使用 TRPM8 敲低的 PC12 细胞(KD 细胞)进行实验。 KD 细胞由清华大学药理实验室提前构建提供。 如图5A 所示,在KD 细胞中,TRPM8(红色)的荧光强度显著减弱,表明细胞中TPRM8蛋白含量降低。 所以我们进一步比较了薄荷醇在野生型 PC12 细胞(WT 细胞) 和 KD 细胞中对TRPM8 和 TNF-α 表达的影响,结果如图 5B~5D 所示,在加入200 nmol/L 和500 nmol/L 薄荷醇时,KD细胞中,薄荷醇不能激活细胞中TRPM8 的表达,同时,薄荷醇失去对细胞中 NF-κB 和 TNF-α 的抑制作用,并且激活了 TNF-α 表达(P< 0.01)。 这一结果证实,在TRPM8 的表达降低后薄荷醇对TRPM8 和TNF-α 的负调控作用受到影响。

图5 薄荷醇对TRPM8 敲低细胞作用Note. WT, Wild type PC12 cells. KD, PC12 cells with TRPM8 knockdown. C, Control group. Compared with control group,**P<0.01.Figure 5 Effect of menthol on TRPM8 knockdown cells

3 讨论

TRPM8 是一种重要的温度感受器受体,环境低温通过激活分布于外周神经系统的TRPM8 受体,引起钙离子内流,进一步通过电兴奋将环境温度变化信息传递至中枢神经系统,产生相应温度变化的“冷感觉”。 除了低温,TRPM8 受体还可以被薄荷醇及其类似激活,同样通过电兴奋,产生“冷感觉”。已有的研究表明,在脑缺血、颅脑外伤、心脏骤停等疾病中,适当降低机体体温,有利于抑制炎症反应。长期以来,薄荷醇作为一种天然小分子药物因其抗炎镇痛的效应被广泛使用。 同时,低温和薄荷醇都可以抑制炎症反应。 因此,在本研究工作中,我们主要探讨了薄荷醇对炎症反应的抑制作用是否与其对冷敏感受体TRPM8 的激活相关。

我们在体内实验(小鼠模型)和体外实验(PC12细胞模型)中都发现,薄荷醇可以促进TRPM8 的表达,抑制 NF-κB 和 TNF-α 的表达。 进一步,PC12 细胞中当 TRPM8 的表达降低,薄荷醇无法激活TRPM8,进一步改变对TNF-α 表达的作用。 这证实了薄荷醇对炎症因子的抑制作用依赖于其对TRPM8 的激活作用。 此外,在细胞模型中,我们还发现薄荷醇对TRPM8 的激活包括两个层面:1)一方面,薄荷醇可以诱导PC12 细胞产生钙内流现象,激活位于细胞膜的TRPM8 作为膜受体的离子通道属性。 2)分子层面,通过免疫荧光成像,可以直观的检测到PC12 细胞胞浆中TRPM8 蛋白表达水平被薄荷醇上调。 分布于细胞膜表面和胞浆中的TRPM8 蛋白具有不同的生物学特点,位于胞浆中的TRPM8 蛋白可能作为信号分子,影响下游基因的转录表达[34]。

NF-κB 作为重要的核转录因子,广泛表达于哺乳动物组织细胞中,主要参与机体对外界刺激的响应,在免疫应答和炎症反应中具有重要作用。 分布于胞浆的NF-κB 与IκB 结合形成无活性的二聚体,当受到细胞外信号激活时,IκB 激酶 IKK 被激活,IκB 降解后使 NF-κB 从 NF-κB-IκBs 复合物中解离,游离的NF-κB 进入细胞核启动下游基因的转录表达[35-36]。 在实验中我们发现,无论是在小鼠还是细胞模型中,薄荷醇对 NF-κB 和 TNF-α 表达的调控具有相同趋势。 薄荷醇可以激活胞浆中TPRM8 的表达,位于胞浆中的 TRPM8 蛋白与 NF-κB 蛋白具有共同的空间,因此薄荷醇激活TRPM8 对 TNF-α 的负调控作用可能有核转录因子NF-κB 介导。 综上所述,薄荷醇能够激活TRPM8,并通过TRPM8 影响了核转录因子 NF-κB 及其下游炎症因子 TNF-α。该结果为薄荷醇抑制炎症反应可能的分子机制提供了一定的理论依据和思考方向,为薄荷醇的临床应用提供了研究基础。