胶质纤维酸性蛋白在新疆哈萨克羔羊肠道内的分布研究

彭凡洋，冷青文

（石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832003）

胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是星形胶质细胞结构中的主要IF蛋白[1]，能够维持神经元的结构，参与细胞内构建、物质转运及信息传递等活动[2]。GFAP的表达量与中枢神经系统发育和星形胶质细胞的增殖分化有关。正常状态下，GFAP免疫反应受星形胶质细胞的动力调节[3]；当机体遭受损伤后，GFAP的表达能促进胶质细胞增生。成熟的肠神经胶质细胞（enteric glial cells，EGCs）内GFAP的表达水平与外界损伤刺激以及EGCs的功能状态密切相关[2]。因此，GFAP被认为是EGCs活化的标记物[4]。

EGCs是肠神经传递和处理信息的中心，其含有神经递质前体，并且能够表达神经递质受体。此外，EGCs能够维持黏膜屏障的完整性，对IEC的生长调节起关键作用。在基因修饰的小鼠模型中，切除肠胶质细胞基因的小鼠暴发了由肠上皮屏障破坏引起的急性肠道炎症[5-7]。研究表明[8]，来自正常小鼠黏膜的肠胶质细胞能够表达神经激肽A和SP，两者都可能作用于免疫细胞和上皮细胞。由此可见，EGCs能够产生细胞因子与其他免疫调节物质，进而调节机体的非特异性黏膜防御功能[9]。

近年来，EGCs在调节肠道健康和慢性疾病上发挥了重要作用，已成为科研人员的研究热点。本试验通过观察新疆哈萨克羔羊肠道中GFAP的分布特征，为绵羊EGCs的分布与功能提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

试验选取9只3月龄的新疆哈萨克羔羊，雌雄不限，平均体重21.2 kg/只。用抹脖法放血屠宰，迅速剖开腹腔，分别切取十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠1～2 cm组织块，用0.9%生理盐水漂洗，再置于4%多聚甲醛固定液（0.1 mol/L，pH7.2）中固定24 h。常规石蜡包埋，制备连续切片，厚度5 μm，干燥后保存备用。

1.2 主要试剂

免疫组化（IHC）试剂盒套装（抗兔）；GFAP兔单克隆抗体；生物素标记羊抗兔IgG抗体；试剂均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学染色

免疫组化SABC-DAB染色按照试剂盒说明书进行操作，石蜡切片脱蜡水化，用0.01 mol/L PBS缓冲液冲洗3次，每次5 min。置于柠檬酸盐抗原修复缓冲液中用微波炉热修复，冷却至室温后取出。在室温下用内源性过氧化物酶阻断剂孵育30 min。切片用山羊血清37℃封闭20 min。擦干切片上多余液体，滴加一抗（1∶500）后切片于湿盒37℃孵育1～2 h，同时用PBS缓冲液作一抗的阴性对照组，0.01 mol/L PBS缓冲液冲洗3次，每次5 min。滴加生物素标记的羊抗兔IgG后切片于湿盒37℃孵育20 min，用0.01 mol/L PBS缓冲液冲洗3次，每次5 min。滴加SABC试剂后切片于湿盒37℃孵育20 min，用0.01 mol/L PBS缓冲液冲洗3次，每次5 min。DAB显色：显微镜下控制时间，暗处反应3～5 min，水洗；用苏木精复染1～5 min，水洗，置于溶液中脱水透明后用中性树脂封片。在光学显微镜（×100）下镜检，并用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0拍照分析。免疫组织化学染色结果描述为细胞着色无、弱（淡黄）、中（棕黄）、强（棕褐）四级。

2 结果

2.1 GFAP在哈萨克羔羊小肠中的分布特点

GFAP在哈萨克羔羊小肠中的分布见图1。由图1A可知，GFAP在十二指肠黏膜上皮层呈不规则的团块状分布，为强阳性；在黏膜固有层呈阳性分布；在固有肌层呈点状分布，为弱阳性。由图1B可知，GFAP在空肠黏膜上皮层呈片状分布，为强阳性；在黏膜固有层也呈强阳性分布；在固有肌层呈点状分布，为弱阳性。由图1C可知，GFAP在回肠黏膜上皮层呈强阳性分布；在黏膜固有层也呈强阳性分布；在固有肌层呈弱阳性分布。

图1 GFAP在小肠各段的表达

2.2 GFAP在哈萨克羔羊大肠中的分布特点

GFAP在哈萨克羔羊大肠中的分布见图2。由图2D可知，GFAP在盲肠黏膜上皮层呈不规则的片状分布，为强阳性；在黏膜固有层呈强阳性分布；在固有肌层呈点状分布，为弱阳性。由图2E可知，GFAP在结肠黏膜上皮层呈强阳性分布；在黏膜固有层呈不连续的片状分布，为强阳性；在固有肌层呈弱阳性分布。由图2F可知，GFAP在回肠黏膜上皮层呈强阳性分布；在黏膜固有层也呈强阳性分布；在固有肌层呈弱阳性分布。

图2 GFAP在大肠各段的表达

2.3 GFAP在哈萨克羔羊各个肠段的光密度值比较

比较GFAP在哈萨克羔羊肠道各个肠段的OD值，结果见图3。在羔羊小肠中，十二指肠GFAP的OD值最大，空肠与回肠次之；在羔羊大肠中，结肠GFAP的OD值最大，直肠与盲肠次之；羔羊小肠的GFAP的OD值显著高于大肠（P＜0.05）。

图3 哈萨克羔羊肠道GFAP的平均光密度

3 讨论

GFAP由432个氨基酸构成，相应的分子量为49.8 kDa，是一种不溶性的单体蛋白[10]。在肠道中，GFAP被认为是成熟EGCs的标记物[11]。越来越多的研究表明，EGCs分泌的GFAP可以调节肠道屏障功能。Costantini等[12]发现，通过刺激表达GFAP可以预防小鼠的回肠通透性增加。用药物治疗EGCs诱导的小鼠结肠炎，可以降低EGCs中GFAP的表达，并且减轻小鼠的炎症反应[13]。研究表明，IBD患者肠道的GFAP表达显著上升[14-16]。因此，GFAP的表达量在一定意义上反映了EGCs的损伤程度。

本研究发现，在新疆哈萨克羔羊肠道中，GFAP在各个肠段均有阳性反应，且主要表达于小肠段，表明在羔羊肠道中EGCs不仅分布广泛，而且可能参与调节羔羊肠道的分泌和吸收功能。EGCs是肠神经系统的主要成分，与肠神经结构紧密相连，并且分布在不同的肠道层内[17]。它具有抗原提呈作用，协同抗原激活肠道细胞免疫系统反应[18]，改善肠黏膜屏障功能。羔羊肠道中EGCs的分布特点可能与肠黏膜屏障的功能有关，本研究结果表明，GFAP在羔羊肠道黏膜上皮层和黏膜固有层呈强阳性分布，在固有肌层呈弱阳性分布，表明EGCs可能既参与羔羊肠道的消化吸收功能，又参与肠道屏障的免疫反应。刘敬贤等[19]研究发现，脊髓受损的大鼠用IL-1β干预后，信号通路JAK2-STAT3被活化，体内GFAP和微支肽表达上升。而IL-6可对STAT3磷酸化施以调控，同时结合GFAP基因启动子，加速体内神经元以及EGCs的增殖[20]。由此可知，EGCs除了能支持肠神经元外，还能促进细胞因子的分泌，缓解肠道炎症，增强机体的肠黏膜屏障功能。

4 结论

GFAP在新疆哈萨克羔羊的各个肠段中均有分布，以小肠为主；在羔羊的肠黏膜上皮层和黏膜固有层呈强阳性分布，在固有肌层呈弱阳性分布；EGCs在羔羊肠道中的分布范围广泛，可能参与调节肠道的诸多生理功能。