超声波辅助反胶束萃取黄牛血中抗菌肽工艺研究

唐惠明，战明月，张浩然，徐佳慧，杨 卓，杨 萍

（吉林农业科技学院 食品工程学院，吉林 吉林 132101）

牛血是典型的碱性食物，能够维持人体的酸碱平衡、提高人体免疫力，减少常见疾病的发生。牛血中含有微量元素铁，对贫血、血虚、闭经等具有一定的治疗效果[1]。牛血还具有非常好的排毒效果，有利于清除人体内堆积的毒素。新鲜牛血中含有的多肽具有抗菌活性，对真菌、原虫、病毒及癌细胞等具有较强的杀伤消灭作用[2]。因此，有必要开发、研究出一种从牛血中提取、纯化抗菌肽的方法。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

1.1.1 原料 从屠宰场取新鲜黄牛血，加入食盐防止牛血因凝固而分离不出白细胞。用200目的纱网过滤，将黄牛血中的不溶物去除。

1.1.2 试剂 氯化钠、氯化钙、氯化镁、异辛烷、CTAC（氯化十六烷基三甲基铵）、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、碳酸钠、碳酸氢钠、浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠、硼酸、盐酸、甲基红、溴甲酚绿、乙醇、酵母菌、酵母浸膏、麦芽粉、明胶。

1.2 仪器

离心机、恒温摇床、高压灭菌锅、凯式定氮蒸馏装置、微生物培养箱、透析袋。

1.3 试验方法

原料处理→分离白细胞→白细胞的破碎→反胶束相系统的萃取→反胶束系统的反萃取→抗菌肽纯化→得到抗菌肽。

分离白细胞：取黄牛血加入3%明胶盐水溶液（选取优质明胶，用生理盐水配成3%溶液），比例为1∶1，于烧杯中混匀。明胶能与红细胞发生粘合作用，使得红细胞快速下沉，白细胞则留在明胶溶液中。用毛细吸管吸取上层清液，放入另一烧杯中。取上述溶液20 ml，加入无Ca2+、Mg2+的Hank's液[3]至离心管口3 cm处，混匀，以水平离心机2 000 r/min离心10 min，弃上清，同法2次[4]。

白细胞破碎：用超声仪裂解细胞，将细胞水溶液放入超声仪中，选用适当的功率，裂解。

反胶束系统的萃取：8 g CTAC置于锥形瓶中，加入100 ml异辛烷，磁力搅拌使表面活性剂完全溶解。加入4 ml 0.01 mol/L的KCl溶液，用KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液调节，使pH=7，摇床振荡2 h。然后用离心机以5 000 r/min的转速离心20 min，溶液若透明，则萃取成功[5]。用Na2HPO4和NaH2PO4分别配制pH=5.5、6.0、6.7、7.1、7.3的缓冲液[6]；将反胶束溶液与白细胞破碎溶液按1∶1加入试管中，振荡摇匀，调节适宜的pH；控制温度、时间、振荡频率，置于恒温摇床中，使抗菌肽转移到反胶束溶液中。

反胶束系统的反萃取：配制pH为10.1～10.3的Na2CO3/NaHCO3反萃取缓冲液，缓冲溶液中乙醇含量为4%，氯化钾的浓度为1.2 mol/L[7]。萃取完后取有机相于离心管中，加入等体积的反胶束萃取溶液，振荡，使其充分混匀。将反萃取后的液体等量放入离心机试管内，转速2 000 r/min，按离心机操作设置好时间即可。离心后用胶头滴管吸出反胶束，重复离心2次，得到抗菌肽水溶液，将抗菌肽水溶液加热干燥，温度不可超过110℃，冷却后即可得到抗菌肽[8]。

1.4 抗菌肽的纯化及定量

选择截留分子量500规格的透析袋剪取15 cm，在2%碳酸氢钠和1 mo1/LEDTA(pH=8.0)的溶液中将透析袋煮沸10 min后用冷水彻底清洗。再放在1 mo1/LEDTA（pH=8.0）中将之煮沸10 min，冷却。将抗菌肽水溶液放入处理好的透析袋内，透析袋内留30%～50%的空间，将空气挤出后放入透析液（10 g NaHCO3+186.6 mg EDTA-2Na+500 ml蒸馏水）中4℃透析，通常4 h左右内外浓度达到平衡，因此每隔4～5小时换透析液1次，即得抗菌肽[9]，凯式定氮法测定蛋白质含量。

1.5 抗菌肽抑菌效果的定性检测

烧杯中加入1 L的纯净水、3 g麦芽粉、0.1 g酵母浸膏，pH调为7.2，配置好后放入锥形瓶密封，用蒸汽灭菌（121℃、30 min），冷却后加入1 g酵母粉37℃培养24 h。将培养液倒入6个培养基中，每个培养基20 ml，分为2组，每组各1个培养基中加入提取物，培养24 h，显微镜下观察酵母菌细胞数目，根据数目多少判定抑菌效果[10]。

2 结果与分析

2.1 pH值对抗菌肽萃取效果的影响

取裂解后的白细胞溶液各10 ml，分别置于5支试管中，加入配置好的萃取缓冲液，调节pH值分别为6.1、7.5、8.4、9.7、10.3。各试管置于恒温仪（20℃）中，振荡频率120 r/min、萃取时间25 min、超声波的频率24 kHz，按照超声波辅助反胶束萃取黄牛血抗菌肽工艺研究中的步骤萃取出抗菌肽。根据测定的总氮量，pH值对抗菌肽提取的影响如图1所示。

图1 pH值对总氮量的影响

由图1可知，在pH值从6.1逐渐增加到9.7的过程中，随着溶液pH值的增加，总氮量明显增加；当pH值超过9.7时，总氮量开始下降。造成这种结果的原因可能是抗菌肽是一种碱性多肽，pH值的增加使抗菌肽的结构更加稳定，从而使总氮量增加；pH值超过9.7时OH-含量过多，影响反胶束体系的稳定性，导致总氮量下降。

2.2 萃取温度对抗菌肽提取的影响

白细胞分离过程中超声波的频率为24 kHz，萃取时恒温仪的振荡频率为120 r/min、萃取pH值为10.3、萃取时间为25 min。温度分别设为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃。根据测定的总氮量，萃取温度对抗菌肽提取的影响如图2所示。

图2 萃取温度对总氮量的影响

由图2可知，总氮量随着萃取温度的升高而升高。温度由15℃升至25℃时总氮量明显增加，当温度超过25℃后总氮量虽有所增加，但不是特别明显。温度越高分子动能越大，分子运动速度越快，使反胶束分子与样品溶液中蛋白质的接触更加频繁，使得总氮量增加；当温度超过25℃时，温度对提取效果的影响快达到临界值，温度的升高对总氮量的影响不显著。

2.3 萃取时间对抗菌肽提取的影响

白细胞分离过程中超声波的频率为24 kHz、恒温仪的振荡频率为120 r/min，萃取时pH为10.3、温度为20℃，萃取时间分别为15 min、20 min、25 min、30 min、35 min。根据测定的总氮量，萃取时间对抗菌肽提取的影响如图3所示。

图3 萃取时间对总氮量的影响

由图3可知，总氮量随着萃取时间的增加而增加。萃取时间为15～30 min时总氮量明显增加，反胶束溶液与样品溶液接触时间增加，使更多的蛋白质进入到反胶束溶液中；当萃取时间超过30 min时，萃取时间对总氮量的影响接近临界值，所以在30 min后萃取时间对总氮量的影响不显著。

2.4 白细胞分离过程中超声波的频率对抗菌肽提取的影响

恒温摇床振荡频率为120 r/min、pH为10.3、萃取温度为20℃、萃取时间为25 min，超声波的频率分别为8 kHz、16 kHz、24 kHz、32 kHz、40 kHz。通过测定总氮量，白细胞分离过程中超声波的频率对抗菌肽提取的影响如图4所示。

图4 超声波频率对总氮量的影响

由图4可知，总氮量随着超声波频率的增大而增加。超声波频率未达到32 kHz前，样液中细胞破裂程度随着超声波频率的增大而增大，细胞的破裂使抗菌肽流出，没有了细胞膜的阻挡，使得抗菌肽能直接与反胶束溶液接触，从而使提取液中的总氮量增加，超声波频率对总氮量有明显影响；超声波频率超过32 kHz后，细胞几乎被裂解完毕，超声波频率对总氮量无显著影响。

2.5 萃取时恒温仪振荡频率对抗菌肽提取的影响

白细胞分离过程中超声波的频率为24 kHz，萃取时pH为10.3、温度为20℃、萃取时间为25 min，萃取时恒温仪的振荡频率分别为40 r/min、80 r/min、120 r/min、160 r/min、200 r/min。通过测定总氮量，恒温摇床振荡频率对抗菌肽提取的影响如图5所示。

图5 恒温摇床振荡频率对总氮量的影响

由图5可知，总氮量随着恒温摇床振荡频率的增加而增加。在恒温摇床振荡频率未达到160 r/min之前，恒温摇床振荡频率对总氮量有显著影响，恒温摇床在试验过程中的作用主要是控制提取温度与搅拌，恒温摇床频率的增加使反胶束溶液与样液的接触更加快速，从而使总氮量增加；在恒温摇床频率达到160 r/min后，恒温摇床振荡频率对总氮量的影响达到临界值，对总氮量的影响不显著。

2.6 试验数据

试验所得数据见表1。

表1 试验数据统计

2.7 方差分析

对试验数据进行spss分析（见表2），并编制因素水平表（见表3）。

表2 主体间效应的检验

表3 因素水平

由表2可知，pH值、萃取温度、萃取时间、超声波频率、恒温摇床振荡频率对总氮量均有显著影响。根据方差分析中的交互作用及实际操作方便、经济、节省开支等既定条件，pH值9.7、萃取温度35℃、萃取时间35 min、恒温摇床振荡频率160 r/min、超声波频率32 kHz为科学的提取条件。

2.8 抗菌肽抑菌效果的定性检测

抗菌肽的抑菌效果见图6、图7，图6的酵母菌数目远大于图7，即在酵母菌培养过程中，加入提取液的培养皿酵母数目明显少于未加提取液的培养皿酵母数目，说明试验提取出来的物质具有抗菌效果。

图6 未加提取液的酵母菌

图7 加提取液的酵母菌

3 结论

本研究以黄牛血为原料采用反胶束法进行提取，得到抗菌肽最佳提取工艺的pH为9.7、萃取温度为35℃、萃取时间为35 min、恒温摇床振荡频率为160 r/min、超声波频率为32 kHz，总氮量达到0.99 mg，抗菌肽的抑制酵母菌效果较好。