HIF-2α在藏羊肺脏的表达分布研究

谢斯玉，谭晓凝，田佳缘，霍庆秀，杨 琨,2,3*

（1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生物医学研究中心/甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学 生物医学研究中心/生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030）

藏羊又称藏系羊[1]，发育成熟晚，主要分布于青藏高原，主要产区在青海。因其耐高寒、耐干旱、喜湿冷等习性，相比于绵羊更适合高原低氧环境而成为西北牧民的主要饲养畜种。此次试验根据藏羊自身耐缺氧的特点开展相关研究。

在适应性低氧反应的调控因子中，本试验所研究的低氧诱导因子家族（HIFs）是不可或缺的一类[2]。在1997年HIF-2α被Tian等[3]克隆出来，前期各种研究表明其mRNA几乎仅在内皮细胞中表达，因此又称为“内皮PAS蛋白1（endothelial PAS domain protein 1，EPAS1）”。HIF-2α和HIF-1α的结构相差不大，属于异源二聚体，分别由功能型亚基HIF-2α和结构型亚基HIF-1β所组成。HIF-2α的N端具有能与DNA结合的basic Helix-Loop-Helix（bHLH）结构域和Per-Art-Ser（PAS）结构域，肺血管对急性和慢性低氧做出反应极其重要的结构域是在其C端含有的转录激活作用的反式活化结构域[4]，HIF-2α能调控血管再生，促进细胞增殖，还具有加快血细胞成熟、肺血管发育等功能[5,6]。在藏羊的肺脏器官中为了提高其细胞对高原低氧的适应性而增加HIF-2α在肺脏的含量，从而使ATP产能增加，减少氧化物产量[7]，进而达到预期效果。本次研究以藏羊的肺脏为试验材料，检测HIF-2α蛋白在藏羊肺脏中的表达分布情况。

1 材料与方法

1.1 材料采集

所有健康藏羊来自临夏回族自治州屠宰场，其肺脏组织均在藏羊放血后用4%的多聚甲醛及时固定采集。

1.2 材料处理

将藏羊的肺脏组织（长、宽均为1 cm左右，厚度不超过5 mm的小块）进行石蜡包埋，染色方法按具体试验步骤进行。

1.3 试验试剂

所用试剂均购自于北京博奥森生物技术有限公司，主要有HIF-2α兔多克隆抗体（bs-1447R）、SP试剂盒（兔）（SP-0023）、DAB染色试剂盒（C02-04001）。

1.4 HE染色法

取大约1 cm3的肺脏组织制成石蜡切片（厚4～5 μm），切片进行HE染色观察藏羊肺脏组织结构的完整性及结构特点。

1.5 免疫组织化学方法检测

将HIF-2α兔多克隆抗体作为HIF-2α抗体，抗体的稀释比例为1∶100，当组织切片加入一抗后，需要在37℃环境下孵育2～3 h。使用免疫组织化学染色方法检测，根据试剂盒说明书进行具体操作。

1.6 结果判定

免疫组织化学染色结果有3种，即强阳性表达（显色结果为深棕色）、弱阳性表达（显色结果为黄棕色）、阴性表达（显色结果为棕黄色）。

2 结果

2.1 藏羊肺脏的组织学结构

藏羊肺脏HE染色结果如图1所示。对HE染色的肺脏组织切片并展开了组织学观察，肺泡在单位面积中数量多且较小，肺泡壁较厚，由扁平细胞和分泌细胞围成肺泡腔。肺泡膈较厚，其内的毛细血管均呈扩张状态。

图1 藏羊肺脏组织切片HE染色法观察结果

2.2 免疫组织化学方法检测HIF-2α蛋白表达

藏羊HIF-2α蛋白免疫组化染色如图2所示，在藏羊肺脏组织中，免疫组化染色结果显示HIF-2α蛋白在终末支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞中的表达高于肌细胞等结构中的表达，为强阳性表达，在肺泡隔间充质细胞可见少量表达。I型细胞中HIF-2α的表达少于肺泡Ⅱ型细胞。

图2 藏羊肺脏组织切片免疫组化观察结果

3 讨论

藏羊已在形态和生理上适应了高原的缺氧环境，其肺组织单位面积中不仅肺泡数量多，血管数量也多，毛细血管内的红细胞数量也有随着海拔高度升高而增加的趋势，这些都有利于增加肺通气量和肺血流量，从而提高藏羊肺脏的肺泡通气量，并加快肺脏中的血氧运输速度。藏羊在低氧环境下肺气体交换率的改变都是基于这些特征，这些适应性变化为藏羊维持体循环和肺循环的正常功能提供了生理条件基础[8,9]。

氧气是调节HIF-2α表达的关键因素。Talks[10]等研究表明，正常氧浓度下除了巨噬细胞外的健康细胞基本检测不到HIF-2α的表达外，通过低氧处理后健康未受损的细胞内可以发现HIF-2α的表达几乎都显著增多。Raghavan等[11]在HPASMCs模型的钻研中得到低氧下肺动脉平滑肌细胞是增殖的，这就是HIF-2α在低氧情况下通过诱导Forkhead Box M1而产生的效果。Cowburn等[12]发现通过HIF-2α能增强下游靶基因Arginase-1的表达，从而引起肺血管重塑和肺动脉高压，表明慢性低氧增加了HIF-2α的稳定性。低氧能够增强HIF-2α在藏羊肺脏中的表达效果，影响藏羊的肺功能，从而推测其是藏羊能在高原低氧环境下生存的重要影响因素。

4 结论

藏羊肺脏在肌细胞等结构的表达程度远低于肺泡导管、终末支气管上皮细胞和Ⅱ型肺泡细胞的表达程度。