探讨高通量测序技术在食品微生物检测中的应用

刘颖

摘要：本文首先分析了高通量测序技术的流程，然后主要论述了在食品微生物检测中对高通量测序技术的应用和应用前景，如宏转录组测序、全基因组测序以及16SrDNA/rRNA测序等，希望可以为相关人员提供一定的参考，将该技术在食品微生物检测上的优势进行充分发挥，保证食品安全，维护国民健康。

关键词：高通量测序;检测技术;食品微生物

引言：

食品微生物是影响食品安全性的关键因素，从近几年市场监督部门对食品抽查结果来看，食品存在的主要问题就是超量添加添加剂以及微生物超标，两个主要问题相比较危害较大是微生物超标。基于此，检测食品微生物的重要性不言而喻，需要将新一代生物学技术——高通量测序应用在其中，保证检测效果。

1高通量测序技术的流程

高通量测序技术的核心原理就是在连接合成的过程中同时进行测序，不需要电泳技术，将DNA的确定方式转变为分析新合成末端标记，常见的主要流程为：首先，构建DNA测序文库。将寡核酸接头增加到DNA样品中，且保证该样品的200到500bp为被打断状态，形成单链文库。其次，完成变性与扩增。即在测序文库建成之后，将芯片表面和DNA片段两端进行连接，实现碱基互补，利用PCR的扩增作用，将DNA进行扩链处理，在其成为双链之后再次进行解链，将最终产出的单链DNA的两端放置在不同位置上，一端在芯片上进行固定、并随机将另一端与其附近的芯片引物进行互补，构成“桥”，利用这种变性循环和桥式扩增，丰富DNA蔟，将碱基信号强度进行不断提升，直至达到要求。最后，将技术测序用可逆化学进行隔断，将经过改造的核酸聚合酶加入其中，起到“可逆终止子”的作用，可以将单个碱基掺入到每个循环中，利用激光技术扫描芯片，进行读条，明确核苷酸类别，并再次进行隔断和读条，以此类推，直至序列可以完成成为双链，实现检测目的[1]。

2在食品微生物检测中对高通量测序技术的应用分析

2.1宏转录组测序

该检测方法属于后基因组学生命科学的产物，可以帮助检测人员深入分析各种已知的食品微生物，也可以帮助检测人员分析未知的食品微生物，通过转录组情况，将研究对象设定为既定环境中的所有RNA，在既定时间中选择合适的环境，将样品微生物群落进行转录，开展大规模测序，从其整体来分析功能与微生物菌落等多种不同关联，鉴定新的具有活性表达特性的微生物，在其基因表达量无法利用常规测序技术进行表达的情况下应用该检测方法具有极大的现实作用，可以完善基因组学，保证检测的完整性和科学性，维护食品安全。此外，该检测方法可以有效进行功能研究和调控表达，弥补基因组缺陷。例如，DeFilippis等人在检测奶酪的过程中，利用宏转录组测序，研究与脂质代谢、氨基酸、蛋白质相关的微生物在奶酪成熟过程里的基因表达会出现明显上调现象，表明在其成熟过程中，微生物功能和菌群会受温度升高的影响而进行改变，强化成熟率。

2.2全基因组测序

早在2011年，技术人员在研究微生物变异和病原菌遗传方面应用全基因组测序，该检测方法可以核苷酸序列（位于整个基因组）进行分析，实现分子分型，当前运用该检测方法在对比分离株基因组方面的途径主要有两种，一种是基于全基因组，对单核苷酸进行多态性分型，另一种则是对核心基因组进行该分型操作。和传统检测方法相比，该检测方法的发展前景和应用价值更大，可以最大化的分析微生物基因组情况，有效识别其中存在的致病菌，从整体上将病原菌的遺传信息、变异信息进行现有技术水平下的全面反映，深入分析食品中的微生物情况，明确其是否存在具有加强耐药基因的食源性致病菌，通过多种基因位点的设计分析，提升检测精度和测序技术的分型能力，在一定程度上该检测方法中的多态性分型在查找部分由食品引起传染病情的源头，延伸测序技术在食品检测领域的应用链，提升应用价值[2]。

2.3 16SrDNA/rRNA高通量测序

该检测该方法具有高度保守的功能和结构，可以将食品微生物不同菌属的差异性进行有效体现，编码核糖体中的其中16SrRNA亚基就用6SrDNA（基因序列）来表示。传统研究16SrDNA序列多样性的方法主要有两种，一种是将基因组进行扩增，将已经被扩增处理的片段放入克隆体中，然后选择检测克隆文库里面的所有序列，检测方式为一代测序技术;另一种则是在粪便PCR扩增物上运用凝胶电泳，明确其序列情况。两种方法的成本都很高，且操作过于复杂的同时分辨率且并不高，不能将微生物特点进行充分反映。而16SrDNA/rRNA高通量测序则可以扩展检测的覆盖面，强化检测深度，提升微生物检测精准程度，全面保证食品安全，可以将混合菌种进行有效且较为快速的分类鉴定，并实现精准定量，从而保证检测结果的可靠性。

2.4宏基因组测序

单个微生物菌株可以进行分离培养的数量较少，只有很少的部分才能进行，而大量微生物的分离培养难以实现，而利用宏基因组测序（生物环境中所有微生物遗传物质之和）可以有效研究微生物基因功能、物种分类、群落结构以及系统进化等，降低对传统检测技术的依赖性，通过对食品样本的采集和有效处理，可以明确其在食用过程中环境以及基因对人体的影响，鉴定食品微生物，其基本使用流程为在既定环境食品样品中采集基因组DNA、选择合适载体进行DNA的克隆工作、将宿主菌体进行导入、结合目的进行筛选。其中。在采集DNA的过程中可以采用理化方法将微生物进行破碎，释放DNA，并结合实际需求进行分离纯化，载入载体进行转化形成微生物无性繁殖系，测定混合基因组序列情况。

结语：

综上所述，高通量测序技术是当前生物技术中发展较为迅速的技术，在食品微生物检测上可以有效鉴定食源性致病菌等微生物情况，避免带有生物污染的食品流入市场，需要加大对该技术的应用和研制，通过实际应用推动该技术的突破，保证其应用质量，维护食品安全。

参考文献

[1]刘天一.我国食品微生物快速检测技术发展现状及趋势[J].现代食品，2020（22）：86-88.

[2]袁佳炼，董林华.微生物检测技术及其在食品安全中的应用探析[J].现代食品，2020（21）：126-128.

（盐城市大丰区综合检验检测中心 江苏 盐城 224100）