巨大芽孢杆菌调控鸡粪中吲哚和粪臭素的产生

邵育新，冯青俊，王明成

（1.河南省平舆县家畜家禽改良站 463000；2.河南省泌阳县动物疫病预防控制中心 463700；3.黄淮学院生物与食品工程学院 463000）

随着畜禽养殖规模化和集约化的快速发展，大量排放的粪污及臭气物质引起的环境污染问题正逐渐成为人们关注的焦点，成为制约发展环境友好型畜牧业的主要因素[1]。伴随着人们对肉制品品质要求的提高，只有对有害因素进行准确地了解测定，才能更好地提出建议，提升生产效率；减轻畜牧业对水源、土壤等环境的污染，推行绿色养殖，满足食物安全需求；巩固我国畜禽产品在国外洋畜禽市场的综合竞争力，发挥重要的经济和社会效益。

吲哚和粪臭素是由饲料蛋白或肠道脱落上皮细胞中的色氨酸在单胃动物后肠厌氧微生物作用下产生的主要降解物，随动物周龄的增长而增加。产生的位置主要在盲肠，与菌群的多样性和含量有关。粪臭素有极强的粪臭味，一部分形成后随粪便排出体外，为主要粪臭源之一；另一部分由肠壁入血，通过血液循环进入肝脏后，部分被代谢由尿液排出，剩余部分则沉积在脂肪、肝脏、肾脏、肌肉中，引起肉产生膻味，降低肉品质[2]。高浓度的粪臭素影响牲畜的生理及呼吸功能，引起急性中毒；低浓的粪臭素可改变动物的神经内分泌功能，降低代谢及免疫功能[2]。另外，吲哚和粪臭素进入体内能够影响酶的功能，如胃蛋白酶和胰蛋白酶。

巨大芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，芽孢杆菌属，常用来生产解磷固钾肥，该菌芽孢具有极强的繁殖力和耐受性[3]。芽孢杆菌可以产生体外酶，如蛋白酶，脂肪酶和淀粉酶等，还可产生降解饲料中碳水化合物的酶类，如果胶酶、纤维素酶等，其中大多数是动物体内无法合成的酶。此外，芽孢杆菌抑制大肠杆菌的活动，扭转蛋白质转化为氨和胺，使粪便和尿液中氨氮的浓度降低，从而达到除臭功能[4,5]。

目前对巨大芽孢杆菌调控吲哚和粪臭素产生的研究较少。探究巨大芽孢杆菌制剂对粪臭素产生的影响，采用分子生物学方法探究其如何影响动物体内微生态平衡具有重要的生产实践意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

黄淮学院生物与食品工程实践实训中心筛选、鉴定、保存的巨大芽孢杆菌（Bacillus megatherium）。

鼓风干燥箱（DHG-92410A，常州诺基仪器有限公司）；光照培养箱（MGC-250，上海恒科学仪器有限公司）；移液枪（Eppendorf， Thermo Fisher Scientific）；立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-50KBS，上海申安医疗器械厂）；超净工作台（SWCJ-2ED，苏净苏洁净化设备有限公司）；可见光分光光度计（721G，上海仪电分析仪器有限公司）；电子分析天平（FA-1004，郑州渠通商贸有限公司）；冰箱（BCD252KU，河南新飞电器有限公司）；真空冷冻干燥机 (D-1A-50，北京博弈康实验仪器有限公司)；立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-50KBS，上海申安医疗器械厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 试验动物处理

将从驻马店建业市场购得的肉鸡在每天的7:00、12:00和17:00进行饲喂。饲粮的各营养组成和含量如表1。并按表2进行分组并饲喂。

表1 基础日粮组成与营养水平

表2 各组肉鸡巨大芽孢杆菌的添加量

1.2.2 试验样品采集

分别在饲喂后0h、24h、36h、48h、72h、96h、120h定时采集两组健康肉鸡的粪便。在饲养期间，距笼底15cm处放一塑料布，跟踪采集塑料布上的直肠鲜粪，立即装入密封袋中，置-20℃冷冻保存，用于吲哚和粪臭素的测定。

1.2.3 吲哚和粪臭素含量测定

本研究选用对二甲基苯甲醛比色法检测吲哚和粪臭素。吲哚和粪臭素可溶于热水，蒸馏时可随水蒸气一同挥发，吲哚和粪臭素中均含有吲哚环，与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛反应，出现玫瑰吲哚而呈红色，玫瑰吲哚在550nm处有吸收，故选取550nm作为检测波长。

1.2.3.1 蒸馏: 取8g粪样放入500mL烧瓶中，进行蒸馏。圆底烧瓶下方适当加热，以确保烧瓶内液体在40～45mL。

1.2.3.2 萃取: 采集馏出液180mL。量取100mL馏出液，置于250mL分液漏斗中，加入饱和Na2SO4溶液3mL，用30mL三氯甲烷进行萃取，摇动2min，静置分层。放出三氯甲烷层置于另一250mL分液漏斗中。在三氯甲烷溶液中加入100mL超纯水，1mL饱和Na2SO4溶液，3mL稀盐酸，摇动2min。将三氯甲烷层移入干净的250mL分液漏斗中，加入10mL显色剂，摇动2min，静置，分离酸层。

1.2.3.3 测吸光度：移取酸层液18mL于50mL容量瓶中，加入20mL冰醋酸(优级纯)，混匀，静置l0min后，用分光光度计在550nm波长处测定其吸光度，同时作空白试验。每组做三个平行试验。

1.2.3.4 绘制浓度曲线：以时间为横坐标，浓度为纵坐标绘制吲哚和粪臭素含量随时间变化的浓度曲线。

2 结果与分析

2.1 吲哚含量的测定结果

通过对二甲氨基苯甲醛法分别测定了试验组和对照组鸡粪中吲哚的含量。结果如图1和表3 所示，试验组吲哚含量普遍较对照组的低，最高达13.60μg/g，最低达到6.58μg/g；而对照组的吲哚含量高达16.01μg/g。统计学分析显示实验组与对照组的吲哚含量在大部分时间点具有显著差异。

图1 吲哚随喂食时间的变化趋势

表3 饲喂前后不同时间吲哚的含量 单位 μg/g

2.2 粪臭素含量的测定结果

同样利用对二甲氨基苯甲醛法分别测定了试验组和对照组鸡粪中粪臭素的含量。结果如图2和表4 所示，试验组粪臭素含量普遍较对照组的低，但相差并不明显，在喂食后第三天差值达到最大为16.99μg/g，且具有显著差异。巨大芽孢杆菌对粪臭素含量产生的影响并不明显，可能是鸡体内的酸性环境不太适合该菌的生长繁殖，致使微生物的调控功能受限。

图2 粪臭素随喂食时间的变化趋势

表4 饲喂前后不同时间吲哚的含量 单位 μg/g

3 讨论

吲哚(Indole) 和粪臭素(Skatole)是L-色氨酸在单胃动物后肠厌氧微生物作用下产生的主要降解产物。吲哚是由L-色氨酸脱氨基生成吲哚丙酮酸，后者脱α-酮戊二酸直接生成吲哚。其中肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中的大肠杆菌(E.coil)、变形菌属(Proteeae)的普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、普罗威登斯菌（Providencia sp.）和摩根菌属(Morganella sp.)可以形成吲哚。而粪臭素的产生是由L-色氨酸脱氨基生成吲哚丙酮酸，后者在多行拟杆菌和柠檬酸杆菌等微生物的作用下脱羧生成吲哚乙酸，进而脱羧形成粪臭素。到目前为止，已知有9种菌株能够产生粪臭素：粪味梭菌（Clostridium scatologenes）、疾病梭菌（Clostridium nauseum）、假单胞菌（Pseudomonas）、根瘤菌（Rhizobium sp.）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、乳酸杆菌11201（Lactobacillus sp. 11201）、产粪臭素奥尔森氏菌（Olsenella scatoligenes）、牙龈奥尔森氏菌DSM 7084（Olsenella uli DSM 7084）和扭曲真杆菌（Faecalictena contorta）[6]。Olsenella scatoligenes是目前已知的唯一从分离到的动物源粪臭素生成菌[7]。

吲哚和粪臭素主要有粪便排出体外，部分通过门静脉运输到肝脏，进入肝脏后大部分可被快速代谢，由尿液排出。另有部分吲哚衍生物被结肠或盲肠末端吸收，绕开肝脏通过腔肠静脉末端直接进入外周血液。据测量，动物每日的粪臭素吸收量在365～820μmol，吸收量可以根据日粮而改变。而吲哚的吸收量约为粪臭素的三倍，为929～2999μmol。二者主要在肝脏中进行代谢，在肾脏和肺等其他器官中也可进行代谢，共分为两个阶段：氧化反应阶段和共轭反应阶段[8]。反应过程中相关酶的活性及表达情况、代谢产物浓度变化反映了粪臭素在肝脏中的分解效率和在组织中的沉积能力，对阐明粪臭素的代谢途径及提高肉品质具有重要的参考价值。

巨大芽孢杆菌能增强机体内酶的活性，使机体对蛋白质的利用率增强，从而减少吲哚和粪臭素的产生[9]。另外，巨大芽孢杆菌能调节肠道菌群；减少有害菌群的感染，改善生产性能[10]；芽孢杆菌对其他一些细菌也有一定的抑制作用[11]。因此，巨大芽孢杆菌可能抑制能够合成吲哚和粪臭素的相关细菌的生长，从而导致吲哚和粪臭素合成受阻。研究表明，巨大芽孢杆菌可以将氨氮作为氮源来进行繁殖，且该菌的生长繁殖和氨氮降解同步进行[12]。利用吲哚和粪臭素合成自身生长所必需的营养物质可能是巨大芽孢杆菌降低二者含量的另一种途径。

粪臭素在畜禽肠道中是连续产生的，完全阻止其生成似乎是不切实际的。目前采取的一些物理学和化学清除粪臭素的方法有一定的效果，但是这些方法引起的成本、能量消耗及二次污染等问题仍然限制了其应用范围。利用微生物进行生物降解与转化成为一种可行的和生态友好型的清除粪臭素的方法[13,14]。目前发现具有降解粪臭素能力的菌株多是在厌氧环境下完成的。厌氧菌降解粪臭素的过程相对较长，且易受氧气等发酵环境的制约，不利于大面积推广。相应地，分离和培养需氧菌对于粪臭素的降解具有重要意义。本研究以好氧菌为研究对象，发现巨大芽孢杆菌可以一定程度上控制吲哚和粪臭素的产生，这对研发除臭剂具有重要的理论意义和应用。