肾病综合征患者血清miR-21表达变化及意义

姜姣姣，汪正翔，朱亚宁，董雄军

芜湖市第二人民医院肾脏内科，安徽芜湖241000

肾病综合征是较常见的一种临床综合征，主要由多种原因导致的肾小球基底膜通透性增加，造成大量血浆白蛋白从尿液中流失，进而导致机体发生一系列病理生理改变的疾病［1］。该病的主要临床特征为水肿、大量蛋白尿、高脂血症、低蛋白血症等，随着病情的发展，可导致各种并发症如急性肾功能衰竭等，给患者的生命健康造成重大影响［2］。然而，目前对肾病综合征病因和发病机制尚未完全明确。微小RNA（miRNA）是广泛存在于生物体内的一种非编码小RNA，经转录后可调控基因的表达，且在细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程中发挥重要作用［3-4］。多项研究发现，多种miRNA在肾病综合征的发生及发展中发挥重要作用。然而，有关微小RNA-21（miR-21）对肾病综合征的影响尚不清楚。基于此，本研究拟通过检测肾病综合征患者血清miR-21的表达，探究其在肾病综合征中的作用，以期为临床诊治肾病综合征提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年5月—2020年3月在本院肾病内科确诊并治疗的肾病综合征患者150例为肾病综合征组。纳入标准：符合2008年出版的《内科学》中有关肾病综合征的相关诊断标准［5］，并经病理检查确诊；入院前未接受其他药物治疗；临床资料完整。排除标准：狼疮性肾炎、乙肝病毒相关性肾炎、银屑病相关肾炎等继发性肾病综合征；严重内分泌疾病；严重心肝等功能障碍；感染性疾病。150例患者中，男84例，女 66例；年龄18～75（42.83 ±5.27）岁；体质量指数（BMI）21.83～22.49 kg/m2。同期选取在本院进行常规体检的健康志愿者150例作为对照组，男79例，女 71例；年龄17～76（43.11 ±5.23）岁；BMI 21.25～22.38 kg/m2。两组临床资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。该研究经本院医学伦理委员会批准；患者及家属签署知情同意书。

1.2 样品采集及保存 于清晨采集两组空腹静脉血5 mL，用JIDI-16R型离心机（广州吉迪仪器有限公司）以3 000 r/min离心15 min（离心半径8 cm），收集上层血清，置于-20℃冰箱保存待测。

1.3 肾功能指标检测 用全自动生化仪检测两组血尿素氮、血肌酐及尿酸水平。

1.4 血清miR-21表达检测 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法。取出待测血清，按照RNA提取试剂盒说明书步骤提取总RNA，逆转录得cDNA。RNA提取试剂盒购于北京甘棠飞华生物科技有限公司，逆转录试剂盒购于上海伯易生物科技有限公司。以上述逆转录合成的cDNA为模板，进行qRT-PCR检测，V115896实时荧光定量PCR仪购于美国Applied Biosystems公司。PCR反应体系20 μL。反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 35 s，72℃20 s，共35个循环。miR-21及U6引物均由苏州鸿讯生物科技有限公司合成。miR-21正向引物5'-GTTAGCTTATCAGACTGA-3'，反向引物 5'-GTGCAGGGTCCGAGGTAT-3'；U6 正 向 引 物 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反 向 引 物 5'-GGAACGCTTCACGAATTTA-3'。 采 用 2-ΔΔCT法 计 算血清miR-21相对表达量。

1.5 血清TGF-β1、IL-18检测 采用ELISA法检测血清TGF-β1、IL-18（ELISA试剂盒购于上海远慕生物科技有限公司）。步骤：将已配制好的100μL标准样品分别加入标准孔和空白孔，于37℃温育30 min后洗涤。将酶标板内液体弃去，拍干后加入酶标试剂，再37℃温育30 min，洗涤后加入显色剂并混合均匀，使其进行显色。最后加入终止液，用酶标仪测定其吸光度（OD值），然后根据标准品浓度和OD值画出标准曲线，采用Curve Expert软件制作标准曲线，计算TGF-β1、IL-18浓度。

1.6 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计量资料以xˉ±s表示，比较采用t检验；用Pearson相关分析法分析肾病综合征患者血清miR-21与TGF-β1、IL-18的相关性，相关系数（r）0.1～0.3为弱相关，0.3～0.5为中等相关，0.5～1.0为强相关；用受试者工作特征（ROC）曲线评估血清miR-21对肾病综合征的诊断价值；用Logistic回归分析肾病综合征发生的影响因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肾功能指标比较 与对照组比较，肾病综合征组血尿素氮、血肌酐、尿酸水平高（P均＜0.05）。见表1。

表1 两组肾功能指标比较（μmol/L，±s）

组别肾病综合征组对照组t P n 150 150血尿素氮20.35±2.13 4.14±1.12 82.497＜0.05血肌酐326.48±32.16 38.72± 6.81 107.21＜0.05尿酸315.42±73.41 279.47±60.52 4.628＜0.05

2.2 两组miR-21、TGF-β1、IL-18比较 与对照组比较，肾病综合征组miR-21及TGF-β1、IL-18水平高（P均＜0.05）。见表2。

表2 两组miR-21、TGF-β1、IL-18比较（-x± s）

2.3 肾病综合征患者血清miR-21与TGF-β1、IL-18表达的相关性 Pearson法分析结果显示，肾病综合征患者血清miR-21与细胞因子TGF-β1、IL-18表达均呈正相关（r分别为0.418、0.452，P均＜0.05）。

2.4 血清miR-21对肾病综合征的诊断价值 血清miR-21诊断肾病综合征的曲线下面积为0.852（95%CI：0.809～0.894），最佳截断值为0.91，此时对应灵敏度和特异度分别为77.3%、78.7%。

2.5 肾病综合征发病的影响因素 以肾病综合征是否发生为因变量（0=否，1=是），血清miR-21、血尿素氮、血肌酐及尿酸为自变量，采用Logistic回归分析，结果显示：血清 miR-21（OR=3.652，95%CI：1.684～7.921，P＜0.05）、血尿素氮（OR=2.869，95%CI：1.395～5.902，P＜0.05）、血 肌 酐（OR=2.928，95%CI：1.592～5.386，P＜0.05）是肾病综合征发生的影响因素。见表3。

表3 肾病综合征发生的危险因素分析

3 讨论

肾病综合征是慢性肾脏病中的常见类型，研究显示该疾病约占肾活检病例的40%，具有发病率高、病情复杂、患者预后差等特点。肾病综合征的典型特征为大量蛋白尿、高脂血症和低蛋白血症，而患者大量蛋白尿长期得不到有效控制，可导致发展为终末期肾病［6］。流行病学研究显示，近年来随着环境、生活方式的变化及人口老龄化问题越来越严重，肾病综合征呈逐年增加的趋势，严重危害患者的健康，且给患者家庭生活带来很大影响。然而，目前对该疾病的发病机制并不完全明确。因此，对肾病综合征进行深入研究，以寻找有效的疾病标志物，对早期诊断和治疗具有重要临床意义。

miRNA是一类广泛存在于真核生物中的长度为19～25 nt的单链非编码小分子RNA，它能以特定方式抑制蛋白质合成，诱发RNA降解，调节基因的转录和表达，并参与机体多种生物学过程［7］。大量研究已证实，miRNA在多种疾病如癌症、心血管疾病及肾脏疾病的发生及发展中发挥重要作用［8］。朱媛媛等［9］研究发现，miR-150在儿童肾病综合征患者血清中表达水平显著升高，且与患儿肾功能损伤、血脂指标密切相关。骆峻等［10］研究发现，肾病综合征患儿肾组织中miR-191表达水平升高，miR-151-3p表达水平降低，且其表达水平与临床血清指标肌酐、总胆固醇等密切相关。以上研究表明miRNA在肾病综合征患者中异常表达，与肾病综合征的发生有关。miR-21是较早发现的一种在人体细胞及组织中广泛存在的miRNA，位于17q23.2染色体的FRA17B脆性区域上，并具有自主转录单位。研究证实，miR-21与多种疾病发生发展密切相关［11］。钟开义等［12］研究发现，miR-21在急性肾损伤患者血清中表达水平升高，且其表达水平与患者病情严重程度相关。王雪艳等［13］研究发现，miR-21是多种肾脏病变的调节因子，在慢性肾脏病、多囊肾、急性肾损伤、肾性肿瘤、糖尿病肾病中表达水平升高，因此下调miR-21的表达可作为一种潜在的治疗策略。本研究结果发现，肾病综合征组血清miR-21表达水平显著高于对照组，提示血清miR-21可能参与肾病综合征的发展进程。

近年来研究发现，多种疾病的发生发展与机体内各种细胞因子的异常变化密切相关。TGF-β1是机体内一种较常见的细胞因子，可调控细胞的增殖、分化，参与炎症反应，并可导致多脏器官纤维化［14］。IL-18是IL家族的重要成员之一，是一种重要的内环境调节因子，可参与炎症反应及免疫应答等［15］。程力平等［16］研究发现，儿童原发性肾病综合征患儿血清TGF-β1和IL-18 mRNA水平升高，且活动期患儿二者水平均高于缓解期，监测两者水平有助于鉴别疾病类型。本研究发现，肾病综合征组血清细胞因子TGF-β1、IL-18水平均显著高于对照组，提示血清细胞因子TGF-β1、IL-18可能参与肾病综合征的发展进程。且肾病综合征患者血清miR-21与细胞因子TGF-β1、IL-18表达均呈正相关，提示二者可能参与调控肾病综合征的发生发展。另外，该研究中ROC曲线分析表明，血清miR-21诊断肾病综合征的曲线下面积为0.852，提示血清miR-21可作为评估肾病综合征发生的指标。Logistic回归分析结果显示，血清miR-21、血尿素氮、血肌酐是肾病综合征发生的影响因素。提示监测三者水平，对临床评估肾病综合征发生有一定价值。

综上所述，miR-21在肾病综合征患者血清中表达明显升高，且与疾病发生发展密切相关，具有一定的诊断价值，提示血清miR-21可作为肾病综合征早期诊断及病情评估的潜在生物学指标。但对其具体的作用机制尚未完全清晰，有待深入研究。