吡非尼酮对慢性传输型便秘小鼠的治疗作用及机制

王博，刘勇，任冰冰，付思齐，姚志伟，孙大庆

天津医科大学总医院儿外科，天津300052

功能性便秘是最常见的消化道疾病，表现为肠道传输时间变慢，粪便干硬，排便次数减少［1］。慢性传输型便秘（STC）作为最常见的功能性便秘，是多种因素（炎症、分泌功能障碍、消化道神经支配的改变）相互作用的结果［2］。研究发现，肠道微生物和短链脂肪酸失衡可能是STC发病的另一危险因素［3］。STC一般治疗包括增加运动量、高纤维饮食以及药物干预。除了高纤维饮食和泻药干预外，益生菌也可以作为STC的替代治疗药物［4］。手术被认为是顽固性STC最后的治疗手段。吡非尼酮（PFD）是目前被欧盟批准的治疗特发性肺纤维化的两种药物之一。PFD可改善轻中度肺纤维化患者的肺功能，降低患者病死率，延长无进展生存期［5-6］。PFD通过多种机制发挥抗纤维化的作用，包括下调转化生长因子β（TGF-β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）表达，抑制炎症反应，降低肌成纤维细胞的活化［7-8］。PFD还是活性氧（ROS）清除剂，可下调氧化相关基因的表达，减少过氧化氢和ROS的产生［9］。研究发现，STC的结肠组织中存在氧化应激损伤［10］。我们前期研究发现，STC患者骨形态发生蛋白2（BMP2）蛋白表达升高。2020年9月—2021年3月，本研究探究PFD对STC小鼠的治疗作用及机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 SPF级雄性BALB/c小鼠50只，6～8周龄，体质量（20±2）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司（合格证号：No.370726201100859673），并于山东大学生命科学院实验动物中心饲养，符合动物伦理学标准。PFD购自大连美仑生物技术有限公司，纯度＞98.5%。洛哌丁胺购自美国Sigma公司；TNF-α抗体购自美国Abcam公司；HE染色试剂盒购自中国南京BioChannel公司；TNF-α抗体、蛋白基因产物（PGP）9.5抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2 动物分组及模型制备 小鼠适应性喂养1周后，将其随机分为对照组、STC组及1、10、100 mg/kg治疗组，各10只。STC组、各治疗组给予10 mg/kg洛派丁胺溶液（美国Sigma公司）灌胃，对照组给予等量生理盐水灌胃，均2次/日，持续2周。自造模第8天，各治疗组在洛哌丁胺灌胃3 h后分别给予1、10、100 mg/kg的PFD灌胃，1次/日，持续1周。

1.3 小鼠一般情况及粪便参数记录 每天对小鼠的体质量、饮水量、摄食量进行监测。实验结束后，采集粪便样本进一步分析。给药14 d后，将小鼠禁食16 h，给予100 g/L活性炭混悬液2 mL灌胃处理。记录各组第1颗黑色粪便排出时间，测量单只小鼠每小时排便次数，并计算粪便含水量，粪便含水量=（粪便湿重-粪便干重）/粪便湿重×100%。

1.4 结肠组织形态学变化观察 干预完成后将小鼠颈椎脱臼处死取结肠段组织，用生理盐水冲洗结肠内容物，剪取新鲜结肠1 cm，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片，切片厚度5μm。组织切片经二甲苯脱蜡和梯度乙醇脱水后，用HE染色试剂盒染色，中性树脂封片后，在光学显微镜（×10）下观察结肠组织形态。剥离小鼠结肠肌层，采用肌间神经元全层铺片，用PGP9.5神经元特异性指标染色。剪取远端结肠段（2～3 cm）置于含氧磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，沿肠系膜边缘切开，清除其内容物，最大限度地拉伸并剥离肌层，用4%多聚甲醛固定过夜。37℃条件下，将肌层用5%山羊血清封闭30 min。孵育PGP9.5抗体（14730-1-AP，1∶100），并在4℃条件下孵育过夜，PBS清洗一抗后，加入二抗并在37℃下孵育1 d。蔡司激光共聚焦显微镜LSM880（×20）观察结肠肌层神经元形态变化。用抗TNF-α抗体进行免疫组化染色评估结肠组织中炎症反应发生的位置及程度。方法：结肠组织石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，将切片浸入柠檬酸钠抗原修复液中煮20 min，取出切片自然冷却致室温，用0.3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶10 min，5%山羊血清封闭10 min，滴加TNF-α抗体（1∶100稀释），4℃孵育过夜，清洗一抗后，二抗室温孵育30 min，滴加DAB显色液于光学显微镜（×20）下观察，着色为棕色特异性区域既存在TNF-α表达。用Image J软件统计TNF-α阳性面积百分比，值越高则炎性反应程度越高。

1.5 结肠组织中BMP2、Smad同源物1（Smad 1）mRNA表达检测 采用定量PCR法。小鼠结肠标本保存于RNAlater溶液（广州大汇生物技术有限公司）中。提取RNA，逆转录获得互补cDNA。采用特异性引物，β-actin上游引物5'-CCACCATGTACCCAGGCATT-3'，下游引物 5'-CGGACTCATCGTACTCCTGC-3'；BMP2 上 游 引 物 5'-CTCCGGGCTATCATGCCTTT-3'，下游引物 5'-ACAACATGGAGATTGCGCTG-3'；Smad1 上游引物 5'-AATACTTCACTGAGGCGGGC-3'，下 游 引 物 5'-CAGTGAGCACATCTGTCCGT-3'。反应体系中PrimeScript酶液1.0μL、引物各1.0 μL、5×PrimerScript buffer2 4.0μL、无菌蒸馏水14μL、cDNA模板10μL。扩增条件：95℃起始10 min，95℃ 10 s、60 ℃ 30 s共40个循环。以β-actin 为内参基因，用 2-ΔΔCt法［11］计算目的基因相对表达量。每个样本重复实验3次。

1.6 统计学方法 采用SPSS25.0统计软件。计量资料用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PFD对小鼠排便的影响 与对照组比较，STC组第1颗黑色粪便排出时间长、排便频率低（P均＜0.05）。1、10 mg/kg治疗组第1颗黑色粪便排出时间、排便频率与STC组比较差异无统计学意义（P均＞0.05）；与STC组及1.10 mg/kg治疗组比较，100 mg/kg治疗组第1颗黑色粪便排出时间短、排便频率高（P均＜0.05）。后续实验选择100 mg/kg治疗组进行观察。见表1。

表1 各组排便情况比较（±s）

表1 各组排便情况比较（±s）

注：与对照组比较，#P＜0.05；与100 mg/kg治疗组比较，*P＜0.05。

组别对照组STC组1 mg/kg治疗组10 mg/kg治疗组100 mg/kg治疗组n 10 10 10 10 10第1颗黑色粪便排出时间（min）83.3±13.4 196.7±63.8#*200.0±69.0*177.3±70.1*98.5± 4.5*排便频率（次/小时）8.43±1.73 2.68±1.33#3.18±1.21 3.22±1.23 5.66±1.82*粪便含水量（%）68.59±15.36 47.50± 9.35#49.22± 5.23 52.32± 6.32 60.88± 2.60*

2.2 PFD对小鼠一般情况的影响 与对照组比较，STC组体质量低，摄食量、饮水量少（P均＜0.05）。与STC组比较，100 mg/kg治疗组体质量高，摄食量、饮水量多（P均＜0.05）。见表2。

表2 各组一般生理状态比较（±s）

表2 各组一般生理状态比较（±s）

注：与对照组比较，#P＜0.05；与STC组比较，*P＜0.05。

组别对照组STC组100 mg/kg治疗组n 10 10 10体质量（g）23.12±0.65 19.15±0.98#21.25±0.74*摄水量（mL）9.02±1.92 5.39±0.65#6.54±1.06*摄食量（g）4.13±1.12 1.99±0.61#2.98±0.55*

2.3 PFD对小鼠肠道组织形态的影响 对照组肠壁结构完整，肠绒毛分布均匀，肠管壁较厚；STC组结肠肠壁组织较薄，肌层变薄明显，可见少许炎症细胞浸润；100 mg/kg治疗组治疗1周后小肠肠壁明显增厚，结肠肠黏膜发育良好，肠绒毛丰厚，排列紧密，炎症细胞浸润减少，组织形态结构正常，未见明显组织病理损伤。对照组、STC组、100 mg/kg治疗组TNF-α阳性面积百分比分别为（0.82±0.25）%、（10.12 ± 0.98）%、（3.12 ± 0.65）%，均在结肠肌层。与对照组比较，STC组TNF-α阳性面积百分比高（P＜0.05）；与STC组比较，100 mg/kg治疗组TNF-α阳性面积百分比低（P＜0.05）。STC组结肠肌间神经分布稀疏，神经纤维变细，胞体减少；而100 mg/kg治疗组神经元的以上变化发生逆转。

2.4 PFD对小鼠结肠组织中BMP2、Smad1 mRNA表达的影响 与对照组比较，STC组结肠组织中BMP2、Smad1 mRNA相对表达量高（P均＜0.05）；与STC组比较，100 mg/kg治疗组结肠组织中BMP2、Smad1 mRNA相对表达量低（P均＜0.05）。见表3。

表3 各组结肠组织中BMP2、Smad1 mRNA表达比较（±s）

表3 各组结肠组织中BMP2、Smad1 mRNA表达比较（±s）

注：与对照组比较，#P＜0.05；与STC组比较，*P＜0.05。

组别对照组STC组100 mg/kg治疗组n 10 10 10 BMP2 mRNA 1.01±0.16 3.12±0.12#1.08±0.03*Smad1 mRNA 1.04±0.11 2.75±0.18#1.08±0.04*

3 讨论

STC是一种常见的功能性便秘，其特点是结肠运动缓慢，肠道传输时间延长，排便次数显著减少甚至不排便，粪便干硬及水分减少。该病为慢性、复发率高，常影响患者的日常生活［12］。研究表明，结肠肿瘤、帕金森病、儿童相关多动症、自闭症及慢性肾脏疾病均与便秘有关［2］。对慢性便秘特别是STC的研究在了解疾病的发生机制及治疗中有重要作用。STC的正常治疗包括饮食控制、运动、使用泻药等。越来越多的研究发现，慢性便秘患者的结肠存在慢性炎症反应与氧化应激损伤，抗炎抗氧化应激治疗也越来越多被应用在便秘患者的治疗中。PFD作为一种新的抗炎抗氧化应激损伤的药物，是否可以用来治疗便秘，其作用方式及潜在的药物靶点尚不清楚。本研究通过PFD治疗洛哌丁胺诱导的STC小鼠，观察便秘相关参数证明PFD对STC的治疗作用。

通过PFD的临床特点与罗马Ⅳ诊断标准，本研究设计了第1颗黑色粪便排出的时间来观察肠道传输时间，以每小时粪便颗粒数作为排便频率，并统计粪便含水量。在STC小鼠模型中，PFD可增加粪便含水量，减少第1颗黑色粪便排出时间，增加排便频率，同时减少炎症细胞浸润，增加结肠肌层厚度，增强肠道动力。BMP2-Smad1调节通路可以调节肠神经元的发生与重塑，同时BMP2升高可增加肠道硝基能神经元，从而增加抑制性神经递质一氧化氮（NO）产生，NO抑制肠道收缩导致肠道传输功能异常。BMP2高表达会导致肠神经元结构与功能异常。本研究显示，PFD可下调STC小鼠结肠BMP2、Smad1基因表达，通过抑制BMP2-Smad1信号轴减少肠道神经元的重塑，逆转肠神经结构变化与肠道调节功能的失常。TNF-α是最常见的周围炎症反应介质，其在慢性与急性炎症反应中水平均升高，在神经性疾病中亦合成增加。STC小鼠模型结肠肌层组织中TNF-α与对照组相比明显升高，且表达位置与肠道神经元存在共定位。说明STC小鼠结肠肌层组织中的肠神经元存在炎症损伤，PFD可减少STC小鼠结肠肌层中的TNF-α表达来发挥抗炎与神经保护作用。

随着对PFD研究的深入，PFD在消化系统中的作用逐渐被发现。PFD可呈剂量依赖性抑制人类肠道纤维细胞的增殖和迁移，但不导致其死亡，从而有效抑制炎症性肠病中肠纤维化的发生发展［13］。PFD可通过抑制氧化应激、巨噬细胞的浸润和炎症小体依赖性的NLRP3途径诱导的炎症，来减轻急性肾损伤［14］。PFD可抑制克隆恩病患者肠道源性成纤维细胞增殖和基质金属蛋白酶的产生，且呈剂量依赖性［15］。这些研究均从PFD对于肠道的免疫调节入手，通过体内与体外实验证明了PFD的抑制肠道炎症的作用。本研究不仅证明了PFD可以有效降低肠道炎症反应，同时发现了PFD可以通过BMP2-SMAD1通路调节肠道神经元的结构与功能，具有神经保护作用。由此可见PFD作为一个常规的抗肺纤维化药物的同时，可通过抗炎作用在多种急性慢性疾病中发挥作用。

本研究中PFD不仅能改善便秘，还能纠正洛哌丁胺诱导便秘导致的小鼠体质量丢失与结肠组织病理的改变。尽管目前有很多植物提取物、多糖、小分子化合物、中草药被用来研究对于便秘的改善作用，但是很少有药物能在100 mg/kg的剂量下，单独处理STC模型小鼠中验证其通便作用，PFD相较于其他通便药物具有较低的起效浓度，并且未出现明显的不良反应，安全性高。接下来的研究中，我们将进一步探索PFD对肠道微生物及其代谢产物的调控作用。

综上所述，本研究验证了PFD在STC的肠道运动中起重要的调节作用。其作用机制可能为PFD能够通过调控BMP2-Smad1信号轴减轻肠神经的损伤，抑制肠道炎症反应，逆转肠道微生物多样性改变，从而直接或间接改善了便秘症状。