结肠癌组织中miR-129-5p、BDNF表达变化及意义

宋立强，张博淼，薛伟男，崔滨滨

哈尔滨医科大学附属肿瘤医院结直肠外科，哈尔滨150081

结肠癌是消化道常见恶性肿瘤，2018年统计显示，我国结肠癌发病率居恶性肿瘤第3位，新发病例达37.6万例［1］。目前结肠癌发病机制尚不完全明确，唯一可治愈的手段为根治性手术切除，但大多数患者确诊时已达中晚期，即使可进行手术治疗，也易出现复发、转移［2］。因此，亟需寻找潜在诊治靶点。微小RNA（miRNA）是一种进化上高度保守的单链非编码小分子RNA，可通过调控靶基因表达参与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭等生物学过程［3］。miR-129-5p为miR-129成熟产物，miR-129-5p在喉癌中呈高表达［4］，但在乳腺癌、结肠癌中呈低表达［5-6］。脑源性神经营养因子（BDNF）是一种神经营养物质，可促进神经细胞分化、生长、修复等。近年研究报道，BDNF与包括结肠癌在内的多种恶性肿瘤发生密切相关，参与肿瘤转移、血管新生等过程［7］。miR-129-5p和BDNF在结肠癌中表达异常，在结肠癌发生发展中发挥重要作用，但关于两者与结肠癌临床病理特征和预后关系的研究较少。本研究对此做了探讨。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年1月—2017年12月本院收治的结肠癌患者118例，男70例，女48例；年龄34～76（53.11 ± 10.54）岁；肿瘤直径＞5 cm 53例，≤5 cm 65例；肿瘤分化程度：高中分化71例，低分化47例；TNM分期［8］：Ⅰ、Ⅱ期64例，Ⅲ期54例；浸润深度：T1、263例，T3、455例；有淋巴结转移56例。纳入标准：经病理检查确诊为原发性结肠癌；初次确诊，未接受任何治疗；临床病理资料完整；接受根治性或姑息性手术。排除标准：合并其他部位肿瘤；严重心、肝、肾等脏器疾病；全身感染性疾病；血液系统疾病。本研究经医院医学伦理委员会批准；患者及家属均知情同意。

1.2 组织中miR-129-5p、BDNFmRNA表达检测 采用qRT-PCR。取术中切除的结肠癌组织及癌旁组织（距离肿瘤组织边缘≥5 cm）。TRIzol总RNA抽提试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）提取组织中总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，Qiagen逆转录试剂盒（上海易汇生物科技有限公司）合成cDNA，加入miR-129-5p、BDNF引物，miR-129-5p正向引物5'-GTCGTATGCTAGCGTGCTTG-3'，反 向 引 物 5'-CAAATATCCGCCCAGTATTG-3'；U6 正 向 引 物 5'-GTCCTATATGGTCATTCCGA-3'，反 向 引 物 5'-ATACGACATTTTCGGCATGG-3'；BDNF正向引物5'-TTAGCGAGTGGGTCACAGCG-3'，反向引物 5'-ATTGGGTAGTTCGGCATTGC-3'；β-actin正向引物 5'-CACGATCGAGGCCGACTATC-3'，反向引物5'-TAATGACGAGATGCAACAGT-3'。分别以U6、β-actin为内参校正，进行qRT-PCR检测。反应体系：SYBR Premix Ex TaqⅡ 12.5 μL、上游引物2 μL、下游引物2μL、DNA 模板 2μL、dH2O 8.5μL。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s循环40次。用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.3 随访 患者出院后均通过门诊或电话方式随访，随访至2020年12月，统计3年总生存率。

1.4 统计学方法 采用SPSS26.0统计软件。偏态分布或方差不齐的计量资料以中位数（上四分位数，下四分位数）［M（QL，QU）］表示，比较采用Z检验；相关性分析采用Spearman相关法；绘制Kaplan-Meier法生存曲线，生存率比较采用Log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌及癌旁组织中miR-129-5p、BDNFmRNA表达比较 结肠癌及癌旁组织中miR-129-5p相对表 达 量 分 别 为 0.67（0.54，0.83）、1.02（0.83，1.24），BDNF相对表达量分别为2.58（1.97，3.11）、1.66（1.49，1.79）。与癌旁组织比较，结肠癌组织中miR-129-5p相对表达量低，BDNF相对表达量高（P均＜0.05）。

2.2 miR-129-5p、BDNF mRNA表达与结肠癌患者临床病理特征的关系 miR-129-5p、BDNFmRNA表达与结肠癌分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移有关（P均＜0.05），与患者性别、年龄、肿瘤直径无关（P均＞0.05）。见表1。

表1 miR-129-5p、BDNF mRNA表达与结肠癌患者临床病理特征的关系

2.3 结肠癌组织中miR-129-5p表达与BDNFmRNA表达的相关性 Spearman相关性分析显示，结肠癌组织中miR-129-5p表达与BDNF mRNA表达呈负相关（rs=-5.174，P＜0.05）。

2.4 miR-129-5p、BDNF mRNA表达与结肠癌患者预后的关系 随访3～36个月，中位随访时间16个月，无失访病例，存活69例，总生存率为58.47%（69/118）。 以 结 肠 癌 组 织 中 miR-129-5p、BDNF mRNA表达的中位数为基准，将结肠癌患者分为高、低表达组。miR-129-5p高表达组3年总生存率为79.03%（49/62），miR-129-5p低表达组3年总生存率为37.50%（21/56）；BDNF高表达组3年总生存率为39.62%（21/53），BDNF低表达组3年总生存率为73.85%（48/65）。miR-129-5p高表达组3年总生存率高于miR-129-5p低表达组，BDNF高表达组3年总生存率低于BDNF低表达组（P均＜0.05）。

3 讨论

我国是结肠癌新发病例和死亡病例数最多的国家，已严重影响和威胁居民生命健康。早期结肠癌主要临床表现为大便性状改变、排便习惯改变、腹部肿块、腹痛或不适等，多不具备典型特征，未能引起患者注意。因此，大多确诊时已达中晚期，失去最佳治疗时机［9］。结肠癌的发生发展是多因素、多基因参与的复杂过程，亟需了解其分子机制，以寻找理想的诊断标志物和特异性治疗靶点。

随着基因组测序技术的快速发展，近年来越来越多无蛋白质编码功能的RNA被发现。miRNA是一类长19～25个核苷酸的内源性非编码小RNA，具备转录后水平调节基因表达功能，多位于肿瘤相关的脆性位点或基因区域，广泛参与肿瘤病理生理过程［10-11］。miR-129-5p为miR-129-1和miR-129-2共同转录产物，近年研究报道其在多种恶性肿瘤中发挥重要作用。如miR-129-5p在肺癌组织中表达显著下调，可通过靶向抑制血管内皮生长因子抑制癌细胞迁移和侵袭能力［12］。miR-129-5p在肝癌组织中表达下调，上调其表达可通过调节钙调蛋白依赖性蛋白激酶4抑制癌细胞增殖、迁移、入侵［13］。但在喉癌组织中miR-129-5p表达显著上调，可通过靶向含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶1促进癌细胞增殖和入侵［4］。提示miR-129-5p可通过调控下游靶基因发挥促癌或抑癌基因作用。本研究结果显示，结肠癌组织中miR-129-5p表达明显低于癌旁组织，与肿瘤分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移相关。说明miR-129-5p可能参与调控结肠癌分化、侵袭、转移等生物功能，具有抑癌基因作用。本研究结果还显示，miR-129-5p高表达组术后3年总生存率高于miR-129-5p低表达组，说明miR-129-5p可能成为评估结肠癌预后的生物标志物。胡俊华等［14］将miR-129-5p转染至结肠癌药细胞株LoVo/5-氟尿嘧啶，发现miR-129-5p可通过靶定胸苷酸合成酶增加癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性，提升5-氟尿嘧啶抗肿瘤作用，细胞毒性检测也显示，转染细胞半数致死浓度从（1 089.70±5.86）μg/L降至（261.40±6.81）μg/L，进一步说明miR-129-5p可能成为结肠癌新的治疗靶点。

BDNF为神经营养因子家族一员，主要分布于内分泌系统、外周神经系统、大脑中枢神经系统，定位于细胞质，可通过结合其配体酪氨酸激酶受体B，维持脑细胞正常生理功能［15］。近年研究发现，多种恶性肿瘤中可检测到BDNF高表达，提示BDNF与肿瘤恶性生物学行为密切相关。如非小细胞肺癌组织中BDNF表达显著上调，可通过PI3K/Akt信号通路促进癌细胞增殖［16］。肝癌组织中BDNF表达显著上调，可通过抑制miR-584表达促进癌细胞增殖、侵袭、淋巴结转移［17］。本研究结果显示，结肠癌组织中BDNF表达明显高于癌旁组织，与分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移相关，说明BDNF可能参与结肠癌分化、侵袭、转移等生物功能，具有促癌基因作用，但关于其作用机制尚不明确。Ras/MAPK和PI3K/Akt信号通路异常与细胞生存、增殖、恶性转变等过程相关，也参与了结肠癌进程［18］。研究表明，BDNF可通过Ras/MAPK和PI3K/Akt信号通路为肿瘤增殖和存活提供正向刺激信号［7］。因此推测BDNF可能通过Ras/MAPK和PI3K/Akt信号通路参与结肠癌发生发展，这有待进一步研究证实。本研究结果显示，BDNF高表达组总生存率明显低于BDNF低表达组，说明BDNF可能成为评估结肠癌预后的生物标志物。进一步分析发现，结肠癌组织中miR-129-5p、BDNF表达呈负相关关系，提示在结肠癌中miR-129-5p与BDNF可能存在靶向调控关系，共同影响结肠癌发生、发展。近期研究报道，多发性骨髓瘤中过表达miR-129-5p能抑制RPMI8226细胞增殖，与BDNF表达呈负相关，miR-129-5p与BDNF存在结合位点，双荧光素酶报告基因实验验证两者存在靶向关系［19］。但对于miR-129-5p是否能靶向负向调控结肠癌BDNF表达发挥作用尚不明确，还有待进一步研究。

综上所述，结肠癌组织中miR-129-5p低表达，BDNF高表达，二者表达呈负相关关系，与结肠癌分化、侵袭、转移相关，有望成为结肠癌诊断和预后评估的标志物。但本研究样本量较少，随访时间较短，还需大样本研究进一步分析miR-129-5p与BDNF的关系。