锌胁迫对国槐幼苗生长及生理特性的影响

刘东超，李 慧，徐瑞瑞，黎俊伶，刘忠华

（北京林业大学生物科学与技术学院/林木育种国家工程实验室/林木、花卉遗传育种教育部重点实验室/国家林业局树木花卉育种与生物工程重点开放实验室，北京 100083）

0 引言

近年来，随着经济社会的飞速发展，环境污染问题越来越受到人们的关注，采矿、“三废”等导致的生态环境中重金属含量超标不仅影响植物的正常生长，还会威胁到人类的身体健康[1]。锌是植物体内必需的微量元素之一，同时也是导致环境污染的重金属元素，当环境中的重金属锌含量超标时，会对植物产生锌毒害，从而影响植物的生长发育和生理功能[2]。研究表明，锌胁迫会减少植物的生物量，抑制植物生长[3-4]。同时，过量锌胁迫会破坏光合器官的结构，抑制叶绿素合成，从而降低植物的光合效率[5]。另有研究表明，当低浓度锌对植物进行处理时，会对植物体内各项生理功能产生促进作用，随着锌浓度的升高，各项生理功能会受到抑制[6]。因此了解和掌握其毒害机理，对重金属胁迫机制的研究是非常必要的。

国槐(Sophora japonica)为豆科(Leguminosae)槐属(Sophora)落叶乔木，是北京、西安、太原等多座城市的市树，具有重要的园林价值和经济价值。研究表明，国槐具有一定的耐寒性、耐盐性和耐旱性[7]，其幼苗在低浓度铅、铜胁迫下可通过自身调节机制来适应重金属对其的氧化胁迫[8]，但国槐对锌胁迫的耐受能力还未有相关研究。同时，有关锌污染对植物造成毒害的问题已广泛引起人们关注，主要以草本植物、水生植物、经济林果为研究对象[9-10]，例如Ouni等[11]研究了锌胁迫处理30天对多年生禾本科植物生长、光合作用、叶绿素荧光和叶绿素浓度的影响，而对多年生木本植物研究较少，尚不清楚重金属锌对国槐的毒害机制。在育苗方面，一般采用土培或土培转水培的方式培育国槐幼苗，但土培试验存在外源处理不均匀、测量不便捷以及植物根系容易遭到破坏等诸多缺陷，试验研究结果不准确，而水培法具有操作便捷、养分均衡等优势，可避免以上问题。

本研究以多年生木本植物国槐为试验对象，经改良霍格兰氏营养液水培得到国槐幼苗，进而分析不同浓度锌处理对其生长发育、叶绿素荧光参数、成熟叶丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性和过氧化氢酶(CAT)活性的影响，旨在了解国槐幼苗对锌胁迫的抗性机理，揭示锌胁迫与国槐幼苗生长及相关生理指标之间的关系，为国槐抗性探索、锌污染地区土地的合理利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试植物及重金属处理

试验于2019年8月—2020年1月在北京林业大学生物科学与技术学院林木育种国家工程实验室进行。供试国槐种子购自河北省保定市安国市万草同源苗木花卉有限公司。优选国槐种子，用85℃热水浸种24 h，种子吸水膨胀后放至湿润纱布上萌发，7天后将胚根突破种皮约3 cm的种子置于装有改良霍格兰氏营养液的组培瓶中继续培养[12]，每瓶200 mL水培营养液，配方见表1。15天后挑选长势一致的国槐幼苗150株，转移到15个装有改良霍格兰氏营养液的收纳盒中，每盒10株，将塑料泡沫板打孔，塞海绵固定植株，营养液每盒3 L，pH 5.7，均4天更换一次。

表1 改良霍格兰氏营养液配方

待幼苗生长3个月后，增施ZnSO4·7H2O固体模拟锌胁迫，根据前期预试验设置Zn浓度分别为1（正常营养液Zn浓度作为对照）、50、200、350、500 μmol/L，共5个梯度，每个处理设3盒重复。在锌胁迫后7、14、21、28天分别取样，测定各项生理指标。

1.2 生长量指标测定

在锌胁迫后28天，收获幼苗测定生长量指标。取样后用直尺（精确度为1 mm）测量其株高、根长，并用分析天平（精确度为0.001 g）分别称量每株幼苗根、茎、叶的鲜重。将称量后的样品分别放入小信封中标记好，置于烘箱中70℃烘干3天至恒重，再用分析天平分别称量干重。根据上述称量结果计算根冠比、根系耐性指数[13]，如式(1)～(2)。

1.3 叶绿素荧光参数测定

在锌胁迫后28天，使用由PhotosynQ平台软件控制的MultispeQ V2多功能植物测量仪，测定国槐幼苗成熟复叶中从基部起第2片小叶的叶绿素荧光参数[14]，包含初始荧光(F0)、PSII最大量子效率(Fv/Fm)、PSII实际量子产量(ΦPSII)、调节性能量耗散的量子产量(ΦNPQ)、叶绿素相对含量(SPAD)。

1.4 其他指标测定

在锌胁迫后7、14、21、28天，分别从基部起摘取第4片成熟复叶，测定幼苗成熟叶中丙二醛含量及3种抗氧化物酶活性。其中，MDA含量采用硫代巴比妥酸显色法测定[15]，SOD活性采用氮蓝四唑光化还原法测定，POD活性采用愈创木酚法测定，CAT活性采用过氧化氢分解法测定[16]。

1.5 数据分析处理

试验数据均以3次重复的平均值±标准差来表示，用Excel 2019进行数据处理和绘图，并用SPSS 26.0进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 锌胁迫对国槐幼苗生长发育的影响

如表2所示，与对照相比，当锌处理浓度不高于200 μmol/L时，国槐幼苗各生长量指标会有所增加，反之，相关生长指标会随着浓度的增加而减少。在50、200 μmol/L锌处理时，株高和根长与对照相比，分别上升了15.44%、22.79%和22.09%、26.91%，其中根长均较对照显著上升(P＜0.05)；在350、500 μmol/L锌处理时，株高和根长与对照相比，分别下降了4.60%、16.92%和6.31%、12.29%。根冠比在50 μmol/L处理时达到最大，而后随锌浓度上升而逐渐下降，但均未达到显著水平(P＞0.05)。国槐幼苗根、茎、叶各组织的鲜重及干重随着锌浓度的增加变化不明显，但仍呈先增加后减少趋势。

表2 锌处理对国槐幼苗生长量的影响

根系耐性指数是指胁迫处理的根系长度与对照根系长度的比值，可反映出植物对重金属胁迫的耐受程度[17]，比值越大表明耐受程度越高。从图1可知，当营养液中锌浓度为50、200、350、500 μmol/L时，根系耐性指数分别为 1.22、1.27、0.94、0.88。在 50、200 μmol/L锌处理时，国槐幼苗的根系耐性指数都大于1，说明该浓度锌处理对幼苗根系的生长有促进作用，随着锌浓度的增加，根系耐性指数均小于1，说明高浓度锌会抑制国槐幼苗根系生长。

图1 锌胁迫对国槐幼苗根系耐性指数的影响

2.2 锌胁迫对国槐幼苗成熟叶叶绿素荧光参数的影响

2.2.1 对F0和Fv/Fm的影响 F0指暗适应状态下最小初始荧光，表示光系统II反应中心全部开放时的叶绿素荧光产量，其值越大表明PSII反应中心受到的破坏越严重[18]。从图2可以看出，处理后28天，50、200 μmol/L锌处理的F0值相比对照分别下降6.47%、11.51%，且200 μmol/L 锌处理显著降低了F0值(P＜0.05)；而350、500 μmol/L锌处理的F0值则分别上升2.75%、14.13%，其中500 μmol/L锌处理使F0值上升显著，说明光系统II反应中心受到破坏较严重。

图2 锌胁迫对国槐幼苗初始荧光的影响

Fv/Fm指的是PSII最大量子效率，反映植物潜在最大光合能力。其正常值在0.75～0.85之间，当植物受到胁迫时，Fv/Fm值会下降[19]。如图3所示，随锌处理浓度的增加，Fv/Fm呈先升高后降低的变化趋势，50、200 μmol/L锌处理时分别较对照显著上升3.12%、4.68%；当锌处理达到350、500 μmol/L时，Fv/Fm则较对照显著下降4.42%、6.36%。

图3 锌胁迫对国槐幼苗PSII最大量子效率的影响

2.2.2 对ΦPSII和ΦNPQ的影响 ΦPSII指PSII实际量子产量，表示光下植物叶片用于电子传递的能量占吸收光能的比例[20]。由图4可见，ΦPSII在50、200 μmol/L锌处理时相比对照略微上升，但差异不显著(P＞0.05)，而在锌处理高于200 μmol/L时，ΦPSII值均低于对照，且在500 μmol/L锌处理时较对照显著下降5.94%。

图4 锌胁迫对国槐幼苗PSII实际量子产量的影响

ΦNPQ指的是PSII处调节性能量耗散的量子产量。如图5所示，在50、200 μmol/L锌处理时，ΦNPQ值相比对照有所下降，但差异不显著，随后逐渐升高，在500 μmol/L锌处理时较对照显著上升20.13%。

图5 锌胁迫对国槐幼苗调节性能量耗散的量子产量的影响

2.2.3 对SPAD的影响 研究表明，叶绿素含量降低是重金属对植物毒害的普遍现象[21]。SPAD即叶绿素相对含量，其值与叶绿素实际含量呈正相关。图6结果表明，SPAD随锌处理浓度升高呈先升高后降低趋势，200 μmol/L锌处理时到达峰值，较对照显著上升18.88%，随后叶绿素相对含量逐渐降低，在350、500 μmol/L锌处理时，分别较对照显著降低9.18%、12.31%。

图6 锌胁迫对国槐幼苗叶绿素相对含量的影响

2.3 锌胁迫对国槐幼苗成熟叶MDA含量的影响

图7 结果表明，同一时期锌处理均使MDA含量呈先减少后增加的变化趋势，50、200 μmol/L锌处理的MDA含量均低于对照，其中200 μmol/L锌处理后7、14、21、28天，MDA含量较同期对照分别显著下降了4.14%、9.94%、21.41%、8.73%(P＜0.05)；而后随着锌浓度的增加，其值也逐渐增加，在350、500 μmol/L锌处理后28天，较同期对照分别上升了5.41%和13.47%。同时，随着处理时间的延长，锌胁迫会导致国槐幼苗的MDA逐渐积累，胁迫后28天各锌处理组的MDA水平达到峰值，分别是处理后7天各处理的1.72、2.14、2.33、2.08倍，说明膜结构受损伤程度较大。

图7 锌胁迫对国槐幼苗成熟叶丙二醛含量的影响

2.4 锌胁迫对国槐幼苗成熟叶SOD活性的影响

图8 结果表明，同一时期锌处理均使SOD活性呈先增加后减少的变化趋势，50、200 μmol/L锌处理的SOD活性高于同期对照，其中4个时期200 μmol/L锌处理的SOD活性较同期对照分别显著上升了5.72%、5.88%、3.90%、4.87%(P＜0.05)；而后随着锌浓度的增加，其值逐渐降低，在350、500 μmol/L锌处理21天和28天时，分别较同期对照显著降低。随着处理时间的延长，锌胁迫导致国槐幼苗的SOD活性整体呈逐渐降低趋势，胁迫后28天各锌处理组的SOD活性达到最低点，为处理后7天各处理的0.988、0.986、0.932、0.949倍，酶活性均有所下降。

图8 锌胁迫对国槐幼苗成熟叶超氧化物歧化酶活性的影响

2.5 锌胁迫对国槐幼苗成熟叶POD活性的影响

由图9可见，同一时期锌处理使POD活性呈现与SOD相同的变化趋势，50、200 μmol/L锌处理的POD活性在7天时上升不显著(P＞0.05)，在处理14、21、28天后均较同期对照显著上升(P＜0.05)，峰值出现在200 μmol/L锌处理后21天，相比同期对照上升了37.71%；同样当锌浓度增加时，POD活性逐渐降低。随着处理时间的延长，锌胁迫导致国槐幼苗的POD活性整体呈先增加后减少趋势，胁迫后21天，各锌处理组的POD活性是处理后7天各处理的1.18、1.32、1.42、1.50倍，而胁迫后28天则分别为处理后7天各处理的1.14、1.26、1.27、1.03倍。

图9 锌胁迫对国槐幼苗成熟叶过氧化物酶活性的影响

2.6 锌胁迫对国槐幼苗成熟叶CAT活性的影响

由图10可以看出，同一时期锌处理对CAT活性的影响与SOD、POD相同，均呈现先增加后减少趋势，50、200 μmol/L锌处理的CAT活性在4个时期均较同期对照显著上升(P＜0.05)，峰值出现在200 μmol/L锌处理后7天，相比同期对照上升了30.76%，而后CAT活性随锌浓度的增加逐渐降低，在350、500 μmol/L锌处理后28天，较同期对照分别下降了5.38%、13.27%。随着处理时间的延长，锌胁迫导致国槐幼苗的CAT活性整体呈逐渐降低趋势，胁迫后28天，各锌处理组的CAT活性达到最低点，较处理后7天各处理分别下降了10.91%、16.75%、20.01%、20.44%。

图10 锌胁迫对国槐幼苗成熟叶过氧化氢酶活性的影响

3 结论

本研究发现，国槐幼苗根系是对锌胁迫最为敏感的区域，短期低浓度锌处理可促进幼苗的生长发育、光合作用及抗氧化酶活性，主要通过提高POD活性来适应重金属对其的氧化胁迫，同时可减少重金属引起的膜脂过氧化作用。当胁迫强度超过国槐幼苗耐受能力后，其生长发育受到抑制，光合机构受到损害，膜质过氧化加剧，在细胞内积累大量丙二醛，抗氧化酶与活性氧自由基平衡被打破，酶活性逐渐降低。由此可见，国槐幼苗能够适应一定浓度的锌胁迫，在浓度不高于200 μmol/L的锌环境下有较强适应能力，在高于200 μmol/L的锌环境下会受到锌毒害，为锌污染地区国槐的种植与国槐抗逆性的探索提供了一定的理论参考。

4 讨论

4.1 锌胁迫与国槐生长指标之间的关系

本研究表明，锌胁迫能使国槐幼苗的各生长量指标在锌处理浓度不高于200 μmol/L时有所增加，反之则减少。说明低浓度锌处理在一定程度上会促进国槐幼苗的生长，高浓度则抑制生长，对国槐幼苗产生毒害作用，这与余国源等[19]的研究结果一致。在植物生长过程中，重金属首先通过根毛进入植物的根部，因此，根系对重金属在植物体内的积累和转运起重要作用。研究发现，除根长外各生长量指标在锌胁迫时基本呈现不显著变化趋势，而根系耐性指数变化显著，说明国槐幼苗根系对锌胁迫反应更敏感，在外源低浓度锌处理条件下生长较好，根系耐性指数均大于1，表明国槐根系对低浓度锌处理有较强的耐受性和适应性；过量的锌可显著抑制国槐幼苗根系生长，由此推测根系伸长受到抑制可能是锌毒害的原初症状[22]，进而影响地上部的生长发育状况。

4.2 锌胁迫与国槐叶绿素荧光参数之间的关系

叶绿素荧光参数是用于描述植物光合作用机理和光合生理状况的指标，其能够准确检测植物的光合机构在逆境下的响应能力，从而反映植物的抗逆性。初始荧光F0代表不参与PSII光化学反应的光能辐射部分，当PSII光合机构受到损坏或者植物本身防御性的激发能热耗散过程加强时F0会上升[23]。随着锌处理浓度的增加，F0呈先减少后增加的趋势，说明50、200 μmol/L锌处理可减少PSII反应中心处于完全开放时的荧光产量，锌浓度过高则会导致PSII反应中心失活，从而引起F0升高。Fv/Fm常用于衡量PSII原初光能转化效率及PSII潜在活力，其值降低可反映PSII复合物的光抑制伤害。本研究表明，Fv/Fm值随锌浓度升高呈先增加后减少的变化趋势，且差异显著，说明低浓度锌处理提升了PSII潜在活力，在高浓度锌胁迫下国槐幼苗受到光抑制从而使光合机构活性降低。PSII反应中心吸收的光量子主要通过光合电子传递、叶绿素荧光及热耗散3个转化途径[24]，ΦPSII为PSII实际量子产量，ΦNPQ则是光保护的重要指标，ΦNPQ较高说明植物接受的光强过剩或可通过调节将过剩光能耗散为热来保护自身。本研究发现ΦNPQ随锌浓度增加呈先减少后增加的趋势，而ΦPSII及SPAD值则为先增加后减少的变化趋势。说明低浓度锌处理可能使传递电子增加，提高植物合成叶绿素的酶活性，提升PSII实际量子产量，使ΦNPQ占比变小；锌处理浓度过高时，抑制叶绿素的合成，PSII受到伤害，降低了电子传递效率，国槐幼苗通过热耗散的形式释放过剩光能。这与保琦蓓等[25]的论述一致。

4.3 锌胁迫与国槐生理指标之间的关系

丙二醛是膜脂过氧化最重要的产物之一，是植物体内ROS过度积累所致的过氧化副产物，其含量是了解膜脂过氧化程度的常用指标，间接表示了膜系统受损程度及植物抗逆性[26]。本研究发现，国槐幼苗的MDA含量随处理浓度增加呈先减少后增加的趋势，同时随胁迫时间的增加而增加，该结果与刘俊等[27]的报道基本一致。说明国槐对锌胁迫耐受能力较强，低浓度锌短期处理会减少MDA含量，这可能与抗氧化酶系统的调节有关，但随着处理浓度、时间的增加，膜脂过氧化加剧，破坏质膜结构。

重金属胁迫可使植物产生过多的活性氧自由基，引起体内代谢失衡[28]。正常情况下，生物体主要通过抗氧化酶系统来清除活性氧自由基，维持活性氧自由基产生与清除系统的平衡。SOD能够催化体内超氧自由基的歧化反应，生成H2O2，而POD、CAT可以催化细胞内H2O2的分解防止过氧化反应[29]。本研究发现，随着锌处理浓度的增加，抗氧化酶活性均呈先增加后减少的变化趋势，当胁迫时间延长时，SOD和CAT活性逐渐下降，POD活性在处理21天达到峰值后开始下降。说明低浓度锌处理激发了国槐幼苗的抗氧化反应，SOD活性升高，对活性氧分子的歧化能力增强，将其转化为H2O2，使得其他抗氧化酶活性增加来清除H2O2，短期处理可提高国槐幼苗抗性，且主要通过提高POD活性来适应重金属对其的氧化胁迫，从而避免锌胁迫带来伤害[30]；随着处理浓度、时间的增加，国槐幼苗的调节能力受到限制，超过所能忍受的最大限度，抗氧化酶活性均出现不同程度的下降，表明当锌胁迫程度较强时，细胞抗氧化能力逐渐减弱，膜脂质氧化伤害程度增加，对锌胁迫的适应能力也明显下降。同时，本研究发现3个抗氧化酶随胁迫时间增加的变化趋势不尽相同，可能还有其他因素参与酶活性调节。

本研究以水培的国槐幼苗为试验材料，分析了不同浓度锌处理对国槐生长发育、光合作用、丙二醛含量及抗氧化酶活性的影响，形成了较成熟的国槐无土栽培培养体系，填补了其在锌胁迫领域研究的空白。但在试验过程中，欠缺对更多生理指标的检测，如活性氧检测、渗透调节物含量测定、金属元素分析等，补充后可发现锌与其他矿质元素的互作关系，将更加全面了解锌胁迫对国槐生长及生理指标的影响。此外，在补充上述试验的同时，还将结合差异基因的表达进行分析和讨论，从而深入掌握国槐的抗性机理。