快速溶剂萃取技术在2种食药用真菌多糖提取中的应用

闫佳佳，万 璐，吴 桐，郑春英

（1黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨 150500；2黑龙江大学生命科学学院/黑龙江省普通高校微生物重点实验室，哈尔滨 150080；3黑龙江大学生命科学学院/黑龙江省普通高校分子生物学重点实验室，哈尔滨 150080）

0 引言

快速溶剂萃取技术是近年发展起来的用于萃取固体或半固体样品的前处理技术[1]，具有全自动、提取效率高、节能环保等特点[2]。随着在食品药品活性成分提取中的广泛应用，该技术已逐渐应用到黄酮[3]、生物碱[4]、酚类化合物[5]等活性成分的提取中。关于快速溶剂萃取技术在多糖提取中的应用报道较少[6]，因此该技术在多糖提取方面还需要进行深入研究。

猪苓(Polyporus umbellatus)及茯苓(Poria cocos)是2种常用食药用真菌，分别为多孔菌科真菌猪苓及茯苓的干燥菌核[7]，有着悠久应用历史[8]。猪苓具有抗菌[9]、抗肿瘤[10]、抗炎[11]、抗病毒[12]、利尿[13]、护肝[14]等作用，其主要活性成分为猪苓多糖[15]、麦角甾醇[16]、生物碱[17]、甾体类化合物[18]等。茯苓具有利尿[19]、抗炎[20]、抗菌[21]、抗氧化[22]、抗肿瘤[23]、镇静[24]等作用，其主要活性成分包括茯苓多糖[25]、脂肪酸[26]、三萜类化合物[27]、甾体类化合物[28]等。在上述2种食药用真菌活性成分中的多糖成分，因具有多种活性作用而备受关注[29]，并可作为食品的主要生产原料用于功能性保健食品的开发应用[30]。

猪苓多糖及茯苓多糖常用的提取方法包括热水提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、酶提法等[31]，但上述方法存在提取效率低、提取时间长等缺点[32]。为提高这2种食药用真菌多糖成分的提取率，并高效分析其多糖成分，笔者在前期研究的基础上[33]，采用快速溶剂萃取法对猪苓及茯苓的多糖成分进行提取，以单因素及正交实验优选快速溶剂萃取法提取2种食药用真菌多糖的最佳工艺条件，以期为食药用真菌多糖的研究提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪苓、茯苓购于黑龙江中医药大学附属第二医院，经黑龙江大学生命科学学院郑春英教授鉴定为猪苓、茯苓。

供含量测定用葡萄糖对照品，纯度＞99.8%，Amresco。

1.2 主要仪器

P/N 10503型快速溶剂萃取仪，美国Applied Separations生产。

1.3 方法

1.3.1 脱脂供试品的制备 分别取2种食药用真菌样品适量，加入乙醇（按料液比1:8加入），热回流2 h，滤液弃去，取药渣低温干燥，即得脱脂供试品，备用。

1.3.2 2种食药用真菌多糖的含量测定 采用蒽酮-硫酸法测定2种食药用真菌多糖的含量[34]。以葡萄糖为对照，以标准曲线法计算2种食药用真菌多糖的含量[35]。

1.3.3 单因素实验

（1）PSE萃取温度对2种食药用真菌多糖的影响。精密称取1.3.1项各样品3.0000 g，置于PSE萃取池中，PSE萃取参数为压力90 bar、提取时间20 min、循环2次，分别在70、80、90、100、110℃下，制备猪苓多糖、茯苓多糖萃取液，合并萃取液，采用1.3.2项的方法测定猪苓多糖和茯苓多糖的含量。

（2）PSE萃取压力对2种食药用真菌多糖的影响。按1.3.3（1）取样，操作，PSE萃取参数为提取时间20 min，循环2次，温度100℃，分别在不同压力(80、90、100、110、120 bar)下，制备猪苓多糖、茯苓多糖萃取液，步骤同1.3.3（1）。

（3）PSE萃取时间对2种食药用真菌多糖的影响。按1.3.3（1）取样，操作，PSE萃取参数为压力90 bar，循环2次，温度100℃，分别在不同萃取时间(5、10、20、30 min)，制备猪苓多糖、茯苓多糖萃取液，步骤同1.3.3（1）。

（4）PSE循环次数对2种食药用真菌多糖的影响。按1.3.3（1）取样，处理，PSE萃取参数为压力100 bar，时间30 min，温度110℃，根据不同的循环次数（1、2、3、4次）制备猪苓多糖、茯苓多糖萃取液，步骤同1.3.3（1）。

1.3.4 正交实验 根据单因素实验的筛选结果，选择并设计L9(34)正交实验的影响因素，PSE提取猪苓多糖和茯苓多糖的因素水平表见表1。

表1 L9(34)正交实验因素水平表

1.3.5 验证实验 根据筛选结果，在最佳提取条件下提取猪苓多糖和茯苓多糖，并与热回流提取法进行对比分析。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察结果

经分析测定，葡萄糖对照品线性方程为Y=7.6030X-0.0157（r=0.9996，线性范围0.02～0.10 mg/mL）。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 PSE萃取温度对2种食药用真菌多糖的影响结果 由图1可以看出，在一定萃取温度范围内，2种食药用真菌多糖含量与PSE萃取温度具有正相关性。尽管萃取温度能够显著影响多糖的提取率，但当温度增至一定程度时，猪苓多糖和茯苓多糖含量的增加并不显著，甚至可能使多糖在高温下发生降解。因此，本实验测定2种食药用真菌多糖含量选择PSE的最佳萃取温度为110℃。

图1 不同PSE萃取温度对2种食药用真菌多糖含量的影响

2.2.2 PSE萃取压力对2种食药用真菌多糖的影响结果由图2可以看出，在一定压力范围内，PSE萃取压力与2种食药用真菌多糖含量的关系趋势均为先增加后降低，萃取压力增高有利于多糖的溶出，但萃取压力过高，则可能会促进多糖的分解。因此，本实验测定猪苓多糖含量时选择PSE的最佳萃取压力为100 bar，测定茯苓多糖含量时选择PSE的最佳萃取压力为110 bar。

图2 不同PSE萃取压力对2种食药用真菌多糖含量的影响

2.2.3 PSE萃取时间对2种食药用真菌多糖的影响结果 由图3可知，2种食药用真菌多糖的含量均随着PSE萃取时间的增长而增加，两者呈正相关性。尽管萃取时间能够显著影响多糖的溶出，但在一定萃取时间内，多糖的溶出会达到平衡，因而持续增加PSE的萃取时间并不能使2种食药用真菌多糖的提取率显著增长。本实验测定猪苓多糖含量时选择PSE最佳萃取时间为20 min，测定茯苓多糖含量时选择PSE最佳萃取时间为25 min。

图3 不同PSE萃取时间对2种食药用真菌多糖含量的影响

2.2.4 PSE循环次数的筛选结果 由图4可知，PSE循环次数对2种食药用真菌多糖的含量增长影响并不明显，循环次数并不是影响对猪苓多糖和茯苓多糖含量的主要因素，若多次循环萃取，高温、高压、长时间萃取还可能导致多糖的降解。根据实际操作情况设定PSE循环次数为2次。

图4 不同PSE循环次数对2种食药用真菌多糖含量的影响

2.3 正交实验结果

根据正交实验表2结果及表3的方差分析可知，PSE萃取猪苓多糖的最佳工艺条件为A3B2C2，PSE温度影响极显著、时间影响显著、压力影响不显著。PSE萃取茯苓多糖的最佳工艺条件为A3B3C3，PSE温度影响显著、时间和压力影响不显著。尽管PSE萃取温度能显著影响2种食药用真菌多糖的含量，PSE萃取时间能显著影响猪苓多糖的含量，但考虑到持续增加提取温度和延长提取时间可能导致多糖的降解，最终确定猪苓多糖最佳PSE提取条件为萃取温度110℃，萃取压力110 bar，萃取时间20 min，循环2次；茯苓多糖最佳PSE提取条件为萃取温度110℃，萃取压力120 bar，萃取时间25 min，循环2次。

表2 正交实验结果

表3 方差分析

2.4 验证实验结果

由表4结果可知，采用PSE提取工艺提取2种食药用真菌多糖，其提取率与传统热水提取法相比有显著提高，从而验证了筛选结果的准确性。

表4 提取方法比较结果(n=3) mg/g

3 结论

笔者以食药用真菌猪苓和茯苓为研究对象，旨在借助PSE萃取技术的高温、高压、高效等特点，改善常见的多糖提取方法存在的提取时间长、提取效率低等弊端[32]，以便高效提取2种食药用真菌多糖成分，并采用单因素及正交实验优选了PSE法提取多糖的最佳工艺条件。研究结果表明，采用PSE法提取猪苓多糖成分的最佳工艺条件为萃取温度110℃，萃取压力110 bar，萃取时间20 min，循环2次；采用PSE法提取茯苓多糖成分的最佳工艺条件为萃取温度110℃，萃取压力120 bar，萃取时间25 min，循环2次。上述结果表明，PSE萃取法提取2种食药用真菌多糖与传统的提取方法相比2种多糖含量有显著提高。

4 讨论

食品活性成分检测需要运用快速、灵敏的分析技术。PSE法作为一种快速前处理技术在很多食品分析中进行了应用，Rizwan等[36]采用PSE法提取食品级辣椒果实中的酚类化合物，结果发现，不同萃取溶剂及萃取温度对酚类化合物的提取率影响显著；Niyaz等[37]采用PSE法提取茶和咖啡中的甲基黄嘌呤，发现萃取温度及萃取溶剂对甲基黄嘌呤的提取率影响显著。尽管PSE技术的应用开展较为广泛，但其在多糖样品提取中的应用并不多见，其中王宇晴等[38]采用PSE法提取灵芝多糖，结果发现，萃取温度及萃取时间对灵芝多糖的提取率影响显著。因此，笔者在前期工作的基础上，将PSE法系统应用于猪苓多糖和茯苓多糖的提取，结果表明，萃取温度及萃取时间对猪苓多糖及茯苓多糖的提取率影响较为显著，考虑到持续增加提取温度和延长提取时间可能导致多糖的降解，笔者优选PSE法提取多糖的最佳工艺条件，从而充分证明了PSE法适用于食药用真菌多糖的快速提取，为食药用真菌多糖的提取提供了一种新方法，也为PSE法的广泛应用提供了参考。