丝素/细菌纤维素/羟基磷灰石骨仿生支架的制备及性能研究 *

谷敏婧，赵飞翔，范苏娜, 2，马 凯，姚 响，张耀鹏, 2

(1. 东华大学 纤维材料改性国家重点实验室，材料科学与工程学院，上海 201620；2. 济南金泉生物科技有限公司，济南 250101； 3. 襄阳市中医医院下肢骨科，湖北 襄阳 441000)

0 引 言

骨是一种致密的缔结组织，在生命活动中起着重要的作用。正常情况下，骨组织有一定的再生和自我修复能力，但是由于严重创伤、肿瘤切除等造成的骨缺损则只能采用骨移植的方法加以修复[1]。目前采用的移植技术存在诸多不足，如二次创伤、并发炎症、免疫排斥、成骨能力有限等问题[2-3]，而骨组织工程技术的发展为骨修复提供了一种新的治疗途径。已有研究报道表明多种材料均可用于骨组织工程支架[4]，其中丝素蛋白(SF)由于其具有优异的生物相容性、可控的降解性、无免疫源性、优良的加工性等，成为了组织工程支架的理想材料之一[5-8]。然而，研究表明纯SF支架在力学性能方面难以匹配骨组织工程的要求[9-10]。细菌纤维素纳米纤维束(BCNR)具有良好的生物相容性和优异的机械性能，将其作为增强材料与SF复合，可进一步提升支架的力学性能和孔径尺寸[11-12]。羟基磷灰石是骨组织中主要的无机成份，而纳米羟基磷灰石(nHAp)的组成、晶型和结晶度与天然骨中的羟基磷灰石极其相似，同时还具有较高的比表面积、生物相容性、骨诱导和骨传导活性等[13-14]。因此，以SF材料为基体，加入BCNR和nHAp，有望制备出结构组成和力学性能均能满足使用要求的骨仿生组织工程支架。冷冻干燥法操作简便，可较好地保留原料组份的生物活性和力学性能，再水化后支架也能较好地保持其结构和强度[15]。因此，本文以SF为基体，BCNR为增强材料，辅以骨活性成份nHAp复合，通过冷冻干燥法制备骨仿生支架，分析了复合支架的微观结构、孔隙率、力学性能、吸水率等性能，验证了细胞在支架上的黏附和增殖能力。

1 实 验

1.1 材料及设备

家蚕茧，浙江桐乡；细菌纤维素，海南椰国食品有限公司；纳米羟基磷灰石，美国Sigma公司；无水碳酸钠，分析纯，国药集团有限公司；溴化锂，分析纯，上海中锂实业有限公司；透析袋，截留分子量(14 000 ± 2 000)，上海源聚生物科技有限公司；DMEM低糖培养液，美国Gibco公司；胎牛血清，美国Gibco公司；三抗(青霉素、链霉素、两性霉素B)，美国Gibco公司；CCK-8试剂盒，日本Dojindo公司。

冷冻干燥机，FD-1A-50，北京博医康实验仪器有限公司；傅里叶红外光谱仪(FTIR)，Nicolet 6700，美国Thermo Fisher公司；扫描电子显微镜(SEM)，Quanta 250，美国FEI公司；电子万能材料试验机，Instron 5969，美国英斯特朗公司；恒温 CO2培养箱，BB15，德国Heraeus公司；超净工作台，BJ-CD Series，上海博讯实业有限公司；酶标仪，Multiskan MK3，美国Thermo公司。

1.2 SF/BCNR/nHAp骨仿生支架的制备

SF水溶液和BCNR的制备过程参照文献[16]。本文固定两者的质量比为SF：BCNR=20：3，改变nHAp组份的含量，使其占复合体系总固含量的比例分别为0、20%、30%、40%，所制备的复合支架(composite scaffold，CS)分别简称为CS0、CS20、CS30、CS40。具体步骤为先将nHAp加入到12 wt%的SF溶液中，随后用磁力搅拌器搅拌均匀，再加入BCNR，继续搅拌，将混合均匀的原料倒入模具中(直径为18 mm，高度为8 mm的圆柱体)成型，放置在-25 ℃下冷却处理12 h，再置于-80 ℃条件下冷冻12 h，最后通过冷冻干燥机将样品冻干。

1.3 支架性能表征

SEM：将制备好的样品干燥后喷金(电流为10 mA，时间为50 s),在10 kV的电压下观察支架的微观结构。支架的片层厚度和间距由Image J软件进行测量分析，单个样品的数据来源于100处测量。

FTIR：将干燥后的支架样品放在研钵中磨碎，再加入溴化钾继续研磨，混合均匀后用磨具压成薄片，采用压片法进行测试。扫描的波数范围为400～4 000 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描次数为16。使用PeakFit软件对红外光谱的酰胺I区进行分峰拟合，计算各支架的无规卷曲/螺旋、β-折叠和β-转角含量。

电子万能材料试验机：样品尺寸：直径为18 mm，高为10 mm。试验机上装载10 kN的传感器，以3 mm/min的速率进行压缩。选取所得的应力-应变曲线中应变为40%处的强度作为支架的压缩强度；支架的弹性模量由应力-应变曲线初始直线部分的斜率得到。

孔隙率测试：将支架样品干燥后称重，并计算样品体积，从而计算出样品的表观密度ρa；通过密度仪测试样品的实际密度ρr，通过以下公式计算支架的孔隙率：

(1)

溶胀率测试：将支架样品干燥后称重，记为Wdry，再将各样品用PBS浸泡，在37 ℃下放置24 h后取出，用滤纸吸干支架表面多余的水分，称重，记为Wwet。溶胀率通过以下公式计算：

(2)

1.4 兔骨髓间充质干细胞的培养和接种

按照2×104cells/cm2的密度将兔骨髓间充质干细胞接种到培养皿(直径为10 cm)中进行扩增培养，每皿添加10 mL的培养液。细胞培养液组成如下：500 mL的DMEM低糖培养液、50 mL的胎牛血清和5.5 mL的三抗混合而成。放在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，每两天全量更换培养液。细胞长满培养皿80%左右后收集制成细胞悬浮液，选取CS0和CS30为代表性支架材料，将细胞接种到经环氧乙烷灭菌的CS0和CS30复合支架上(1×106cells/支架)，随后将已接种细胞的支架放到6孔板中(每孔放置1个支架)，放入37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中孵育4 h后，每孔加入6 mL细胞培养液后放入37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养，每两天全量更换一次培养液。

1.5 典型支架材料中的细胞活力检测

按照CCK-8试剂在细胞培养液中体积比为10%的比例配置CCK-8检测液，将接种细胞后培养1天和7天的支架样品(CS0和CS30)取出放入24孔板中，每孔加入1 mL已配好的CCK-8检测液，放在细胞培养箱中孵育2 h，再将孵育完成的CCK-8溶液部分转移至96孔板，每孔100 μL，用酶标仪测定OD值。

1.6 数据的统计学分析

实验数据均采用平均值±标准差的形式，通过Origin中的one-way ANOVA检验实验数据是否具有显著性差异，p < 0.05表示存在显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 不同nHAp含量对复合支架微观孔隙结构的影响

支架中孔的几何特征，包括孔的形态、孔径、孔隙率、互通性等，是影响组织工程中细胞黏附、迁移、增殖以及营养物质运输的重要因素[17]。本文采用SEM表征复合支架的形貌结构。由图1(a)可知，SF/BCNR二元复合支架(CS0)具有明显的骨仿生片层结构，其中SF作为主体材料，形成骨架片层；BCNR部分贴附在片层表面，部分穿插在片层之间，以增加片层结构的稳定性及支架的机械强度，这与已有文献报道较为吻合[16]。为进一步提升支架的仿生性能，本文构建了SF/BCNR/nHAp三元复合骨支架。实验结果表明，nHAp的负载并不会阻碍或破坏骨仿生片层结构，如图1(a)所示。同时，nHAp颗粒的存在使支架表面更粗糙，理论上将更利于细胞的黏附。对支架的片层结构进行半定量表征，取距支架中心4 mm的位置计算骨仿生支架的片层间距和片层厚度，测量结果如图1(b)所示，随nHAp负载量的增加，片层间距明显增大，从(22.39±6.89)μm(CS0)增大到(72.83±28.14)μm(CS40)，其原因可能是由于nHAp部分穿插在片层间所致。此外，负载nHAp的三元复合支架的孔隙率较SF/BCNR二元复合支架也有明显提升，在CS30和CS40支架中可达到85%，如图1(c)所示。统计结果表明，三元复合支架和二元复合支架的孔隙率存在显著性差异。上述结果表明，具有骨活性nHAp组份的负载不会阻碍或破坏骨仿生片层结构的形成，还可增大片层间距、提升支架孔隙率和表面粗糙度。SF/BCNR/nHAp三元复合进一步提升了骨支架在结构和活性上的仿生程度，有利于促进骨组织的修复和再生能力。

图1 不同nHAp含量SF/BCNR/nHAp复合支架的微观孔隙结构(a)SEM图，(b)片层厚度和间距，(c)孔隙率(*代表数据之间存在显著性差异，n=3，p<0.05)Fig 1 Microscopic pore structure of SF/BCNR/nHAp composite scaffolds with different nHAp contents: (a) SEM images; (b) Lamellar thickness and interlamellar gap; (c) porosity (* represents the significant difference between the date, n = 3, p < 0.05)

2.2 不同nHAp含量对复合支架二级结构的影响

图2 不同nHAp含量SF/BCNR/nHAp复合支架的红外光谱图(a)红外光谱图，(b)二级结构分析(*代表数据之间存在显著性差异，n=3，p<0.05)Fig 2 FTIR spectra of SF/BCNR/nHAp composite scaffolds with different nHAp contents (a)FTIR spectra; (b) secondary structure analysis (* represents the significant difference between the date, n=3, p< 0.05)

2.3 不同nHAp含量对复合支架力学性能的影响

为满足骨组织修复的要求，理想的仿生支架材料还需具有完全匹配的力学性能。在本研究中，未添加nHAp时，SF/BCNR二元复合支架CS0的压缩强度为(2.69±0.22)MPa；添加nHAp后，SF/BCNR/nHAp三元复合支架的压缩强度先降低后增加，随后再降低，且CS0和CS20、CS40的压缩强度具有显著性差异，如图3(a)所示。当nHAp的含量为30%时，支架的压缩强度为(2.08±0.23)MPa，与CS0无显著性差异，依然在与松质骨匹配的压缩强度(2～12 MPa)范围内[20]。另一方面，SF/BCNR/nHAp三元复合支架的弹性模量随nHAp的添加先增加后减小，如图3(b)所示。其中CS30的弹性模量最高，为(26.56±2.16)MPa。产生上述结果的原因很可能是nHAp的添加使得支架的片层间距增大，进而导致抵抗压缩的能力降低；但由于nHAp纳米颗粒自身的支撑作用，支架的弹性模量先有所增加，在30%左右达到峰值，随着含量的进一步增加(40%)，过量的nHAp可能导致纳米颗粒聚集，使复合材料的结构不均匀，进而导致支架的弹性模量和压缩强度都有明显降低，这与Farokhi等人文献中nHAp含量的过度增加导致纳米颗粒聚集，进而导致SF/nHAp支架力学性能降低的报道较为一致[14]。同时，有研究表明细胞的生长分化能力与组织工程支架的力学性能有密切关系，与骨组织匹配的力学性能可促进骨细胞特异性基因的表达[21-23]。综合各项力学性能参数，在SF/BCNR/nHAp三元复合支架中，CS30更能匹配松质骨的力学性能要求。

图3 不同nHAp含量SF/BCNR/nHAp复合支架的力学性能(a)压缩强度，(b)弹性模量(*代表数据之间存在显著性差异，n=3，p<0.05)Fig 3 Mechanical properties of SF/BCNR/nHAp composite scaffolds with different nHAp contents: (a) compressive strength; (b) elastic modulus (* represents the significant difference between the date, n=3, p<0.05)

2.4 不同nHAp含量对复合支架溶胀率的影响

骨缺损的修复效果还依赖于营养物质和代谢产物在组织工程支架中的传输和交换效率。由图4可知，加入nHAp后，SF/BCNR/nHAp三元复合支架的溶胀率有一定程度的提升，但各复合支架的溶胀率并无显著性差异。可能原因在于nHAp的负载增大了支架的孔径和孔隙率，如图1(b)、(c)所示，进而使得其可容纳的水分子增多，连通性增强，从而使溶胀率的平均值有一定提升。高的溶胀率利于营养物质和代谢废物的输送，从而利于细胞的黏附和生长[24]。由此可见，负载nHAp的三元复合支架有望更利于细胞的黏附和生长，SF/BCNR/nHAp三元复合支架CS30具有最优的骨组织仿生性能。

2.5 nHAp的负载对复合支架上细胞黏附和增殖能力的影响

支架材料在体外的细胞黏附和增殖能力评估能够间接反映其在体内对缺损组织的修复潜能。CCK-8试剂盒可简便准确地检测支架材料上的细胞活力(同时可间接反映相对细胞数量)。典型支架材料(CS0和CS30)上细胞活力的检测结果如图5所示，从1天的结果来看，与CS0相比，CS30上的细胞活力更强，CS0的OD值与CS30的值存在显著性差异，表明SF/BCNR/nHAp三元复合支架更利于骨髓间充质干细胞的初始黏附。随培养时间的延长(7天)，相对细胞活力(OD值)明显增大，表明骨髓间充质干细胞在两种复合支架上都有明显的增殖，但CS30上的细胞活力明显更强，OD值存在显著性差异。与SF/BCNR二元复合支架CS0相比，SF/BCNR/nHAp三元复合支架CS30更有利于细胞的初始黏附及后续的细胞增殖。该结果证实了具有骨活性成份nHAp的引入提高了支架上干细胞的黏附和增殖能力，进一步提升了三元复合支架的细胞相容性，展现了SF/BCNR/ nHAp三元复合骨仿生支架在骨组织修复方面的潜力。

图5 细胞在CS0和CS30复合支架上的细胞活力评估(*代表数据之间存在显著性差异，n=3，p< 0.05)Fig 5 Cell viability assessment of cells on the composite scaffolds of CS0 and CS30 (* represents the significant difference between the date, n=3, p<0.05)

3 结 论

(1)在SF/BCNR二元复合支架的基础上，骨活性成份nHAp的负载并未阻碍或破坏支架中骨仿生片层结构的形成，对支架中SF的二级结构也无明显影响，但增大了SF/BCNR/nHAp三元复合支架的孔径、孔隙率和溶胀率，提升了三元复合支架的仿生程度。

(2)适量nHAp(30%)的加入使三元复合支架CS30的压缩强度和弹性模量等力学性能能够更好地匹配松质骨的力学性能要求。

(3)与SF/BCNR二元复合支架相比，骨活性成份nHAp的加入明显提高了骨髓间充质干细胞在SF/BCNR/nHAp三元复合支架上的黏附和增殖能力，体现了该支架在骨组织修复方面的潜力。