PTEN在颅底脊索瘤患者中的表达及其与临床病理学和预后的关系

田凯兵，王亮，马骏鹏，王科，张俊廷，吴震

(首都医科大学附属北京天坛医院神经外科，北京 100070)

脊索瘤是一种起源于脊索组织残余的低度恶性肿瘤，主要发生在骶尾部(29%)和颅底(32%～42%)，发病率为(0.080～0.089)/10万，患病率男性[(0.100～0.160)/10万]高于女性[(0.060～0.066)/10万][1]。脊索瘤对邻近软组织有局部侵袭性，对周围骨骼破坏性明显。颅底脊索瘤常包绕血管、脑神经等重要结构，患者常出现脑神经功能障碍症状，包括头痛、复视、视力下降、视野缺损、吞咽困难、面瘫、感觉障碍等。彻底切除颅底脊索瘤较困难，往往会引起严重的并发症，目前推荐的治疗方案为尽可能手术切除辅助术后放疗，术后肿瘤进展是困扰患者和神经外科医师的难题[1-5]。近年来，尽管有突破性的创新方法应用于颅底脊索瘤患者的临床治疗，但对该病分子水平的认识仍不足[6]。人第10号染色体上缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)是一种肿瘤抑制蛋白，在多种恶性肿瘤中表达[7-9]。本课题组前期研究发现PTEN的表达与颅底脊索瘤骨质侵袭程度有关[10]。本研究主要探讨PTEN与颅底脊索瘤临床病理学和预后的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2008年1月至2015年11月在首都医科大学附属北京天坛医院神经外科接受手术治疗的颅底脊索瘤患者53例，其中男30例、女23例，年龄11～62岁，平均(39±14)岁；肿瘤直径18～85 mm，平均(46±14) mm；术前KPS评分40～90分，平均(80±13)分；术中肿瘤侵袭性切除26例，非侵袭性切除27例。随访时间3～62个月，无失访。本组13例患者死亡，36例患者出现术后肿瘤进展，中位PFS 17.83个月，3年无进展生存率为49.50%。首次手术后，22例患者因肿瘤进展再次手术，1例患者再次接受了2次手术，2例患者再次接受3次手术，1例患者由于多次术后肿瘤进展而接受了另外4次手术。

纳入标准：①年龄11～62岁；②患者或家属具备正常沟通、交流能力，配合术后随访；③患者及家属均签署了知情同意书。排除标准：①合并颅内外其他严重疾病，如脑血管病、心肌梗死；②合并其他部位、类型肿瘤者；③存在认知、心理及精神障碍者。所有患者肿瘤石蜡样本为术中肿瘤取出后30 min内用10%甲醛固定，24 h后将样本进行石蜡包埋。冰冻组织样本在术中取出后30 min内储存于液氮中。肿瘤组织石蜡样本及冰冻样本均存放于首都医科大学附属北京天坛医院临床医学研究中心。

1.2主要试剂和仪器 封闭用山羊血清(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：20081901)；PTEN抗体(英国Abcam公司，批号：GR154649-2)；二抗Goat Anti-Rabbit IgG (H+L),HRP Conjugate(北京全式金生物技术有限公司，批号：20020219)；DAB染液(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：2040A0925)；TRIzol(美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：15596018)；带有gDNA Erase的PrimeScript RT试剂盒(日本Takara公司，批号：AJF1731A)；聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)试剂盒TaqManTMUniversal Master Mix Ⅱ,no UNG(美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：4440048)；TaqMan探针(美国Thermo Fisher Scientific公司，PTEN：Hs02621230-g1，GAPDH：Hs02758991-g1)。

包埋仪(EG1150C)、免疫组织化学一体机(ASP，200S)、显微镜(DM2000)、切片机(RM2245)[徕卡显微系统(上海)有限公司]；PCR扩增仪(美国Applied Biosysterms公司，PCR System 9700)；PCR仪(瑞士罗氏公司，LightCyler480 PCR)。

1.3方法

1.3.1PTEN蛋白的检测 石蜡样本制作5 μm切片，试验开始前60 ℃烤片2 h，经过脱蜡、水合，应用柠檬酸钠进行抗原修复，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，抗原封闭，一抗(1∶400倍稀释)4 ℃孵育12 h，二抗(1∶250倍稀释)室温孵育1 h，DAB染液显色，复染后脱水、透明、封片[11]。

每例样本由两位病理科医师分别随机评估400倍镜下的阳性率及染色强度，依据染色强度、染色百分率进行评分。染色强度评分：0(无染色)，1(染色弱)，2(中等染色)，3(强染色)。染色百分率评分：0(0%)，1(<20%)，2(20%～50%)，3(>50%)。染色强度和百分率评分之和为最终评分，最终评分0～2分定义为低表达，3～6分定义为高表达[11]。

1.3.2PTEN基因的检测 采用TRIzol提取mRNA，20 mg组织添加1 mL TRIzol，步骤如下：研磨组织制作组织匀浆，加TRIzol室温放置10 min，4 ℃下12 000 ×g离心5 min，取上清液加入氯仿(1 mL TRIzol加入200 μL氯仿)，4 ℃下12 000×g离心15 min，取上层水相加入异丙醇(1 mL TRIzol加入0.5 mL异丙醇)室温放置10 min，4 ℃下12 000×g离心10 min，弃去上清液，75%乙醇(1 mL TRIzol加入1 mL 75%乙醇)洗涤RNA，4 ℃下7 000×g离心5 min，弃去上清液，晾干5～10 min，无菌纯水溶解。

使用带有gDNA Erase的PrimeScript RT试剂盒依据说明书进行逆转录反应，依据说明书配置溶液后置于PCR扩增仪去除组织DNA并逆转录。使用TaqManTMUniversal Master Mix Ⅱ,no UNG实时定量PCR试剂盒，TaqMan探针法进行实时定量PCR反应。靶片段在10 μL系统中扩增。反应过程如下：95 ℃ 10 min，40个循环：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s。结果取每个样本2-ΔΔCT值代表PTEN基因表达水平进行分析[12]，肿瘤2-ΔΔCT值高代表肿瘤中PTEN表达水平高，样本2-ΔΔCT值计算过程如下：ΔCT=CTPTEN-CTGAPDH；2-ΔΔCT=2-(ΔCT-ΔCT所有样本均数)。

1.4临床评价 收集患者的临床资料，包括性别、年龄、术前KPS评分、肿瘤直径、侵袭类型、分期、分隔、质地、切除方式、病理类型。其中肿瘤质地分为软和硬(后者包括软韧不均成分的肿瘤)，肿瘤分隔分为瘤内无纤维分隔和有纤维分隔。随访主要在门诊患者中进行，对少数不能就诊的患者采用电话随访。所有组织学标本均由至少两名有5年以上脊索瘤分析经验的病理学医师观察，根据国际癌症研究机构分型进行病理分型(包括经典型、软骨样型和未分化型，本研究样本中无未分化型)[13]。所有磁共振成像影像资料由两位具备5年以上颅底肿瘤诊断经验的放射科医师使用影像存档与通信系统进行评估：记录肿瘤直径；侵袭性分为骨侵袭性(侵犯周围骨)和非骨侵袭性；分期根据是否存在硬脑膜破坏而定；切除方式包括侵袭性切除(切除程度>90%)和非侵袭性切除(切除程度≤90%)。术后肿瘤进展定义为残余肿瘤再生长或复发。分析患者PTEN蛋白、PTEN基因表达水平与以上临床病理学及无进展生存期(progression-free survival，PFS)的关系。

2 结 果

2.1PTEN蛋白表达结果 PTEN主要分布于基质、细胞质和细胞核，PTEN蛋白低表达26例，高表达27例。PTEN蛋白高表达与低表达者的年龄、术前KPS评分、肿瘤直径比较差异无统计学意义[(34±15)岁比(38±14)岁,t=1.207,P=0.233；80(70,90)分比75(70,80)分，Z=-1.156,P=0.248；(43±16) mm比(48±10) mm,t=1.309,P=0.196]。Kaplan-Meier分析结果显示，PTEN蛋白低表达者术后PFS较高表达者显著缩短[(9.00±1.91)个月比(35.00±3.18)个月](P<0.05)。见图1。

PTEN：人第10号染色体上缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物

PTEN蛋白表达在颅底脊索瘤患者不同性别、分期、分隔、切除方式及病理类型方面差异无统计学意义(P>0.05)；但PTEN蛋白表达在不同侵袭类型、质地方面差异有统计学意义(P<0.05)，非骨质侵袭肿瘤中PTEN蛋白高表达率低于骨质侵袭肿瘤，质地软的肿瘤中PTEN高表达率高于质地硬的肿瘤(P<0.05)。见表1、图2。

表1 颅底脊索瘤PTEN蛋白表达结果 [例(%)]

2.2PTEN基因表达结果 PTEN基因的表达水平与患者年龄、肿瘤直径、术前KPS评分无关性(r=-0.210，P=0.128；r=0.080，P=0.554；r=-0.070，P=0.643)；不同性别、侵袭类型、分期、分隔、质地、切除方式、病理类型间PTEN基因表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 颅底脊索瘤患者PTEN基因表达结果

3 讨 论

脊索瘤是一种少见的慢性低度恶性肿瘤，以骶尾部和颅底较常见。脊索瘤多呈浸润性生长，对周围骨组织破坏严重，术后易复发，患者远期预后差，给临床治疗带来很大挑战[1]。目前尚无针对脊索瘤的有效药物治疗方案，为明确相关作用因子和通路，包含较多样本的蛋白质、基因水平的研究亟待开展，本研究基于前期研究结果，着重探讨在颅底脊索瘤中PTEN的蛋白和基因表达水平。

2a:骨侵袭肿瘤，染色较浅，阳性细胞多，阳性部位主要位于胞质和细胞间基质；2b:非骨侵袭肿瘤，染色深，可见阳性细胞核，所有肿瘤细胞染色；2c:质地软的肿瘤，在细胞质和细胞间基质中呈强阳性染色；2d:质地硬的肿瘤，染色较浅，偶见阳性染色；PTEN：人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物

PTEN是一种常见的肿瘤抑制基因，其翻译产物 PTEN蛋白在细胞脂质信号磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸的去磷酸化过程中起作用，影响细胞生长、增殖和分化等过程。此外，PTEN抑制其他途径，如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)激酶靶点调节细胞生长，也可部分调节磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)活性[14]。PTEN在多种肿瘤中发挥作用，包括前列腺癌、乳腺癌、胶质瘤、胰腺黏液性非肿瘤性囊肿和骨髓相关肿瘤[15-16]。近年来，脊索瘤中也有PTEN表达的报道[17-18]。本研究结果证实，PTEN蛋白与肿瘤骨质侵袭性和质地及PFS显著相关，PTEN基因与患者临床病理学及PFS无相关性，提示在颅底脊索瘤中PTEN发挥作用主要通过其蛋白表达调控而非基因表达。

PTEN蛋白低表达与肿瘤的侵袭性相关。Lee等[14]研究证实脊索瘤中PTEN杂合性缺失可导致脊索瘤细胞侵袭性增加，本研究结果与本课题组前期研究结果一致[10]，PTEN蛋白表达与颅底脊索瘤骨质侵袭性相关。研究发现，PTEN无表达和mTOR表达与骶尾部脊索瘤侵袭性及临床预后相关[11]。另外，Wang等[19]发现PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)在PTEN减少的乳腺癌腋窝淋巴结转移中被激活，推测PI3K/Akt通路的激活与肿瘤的侵袭和迁移有关。Puzio-Kuter等[20]研究证实，mTOR通路在前列腺癌的侵袭性中起重要作用。由此推断，PTEN也可通过调节PI3K/Akt/mTOR通路间接调控颅底脊索瘤的侵袭性，肿瘤中PTEN高表达，PI3K/Akt/mTOR通路受到抑制，肿瘤对周围骨质侵袭能力增强，而肿瘤中PTEN低表达PI3K/Akt/mTOR通路激活，导致肿瘤侵袭能力减弱。

虽然PTEN表达与肿瘤组织质地的关系较少见报道，但本研究结果显示，质地软的PTEN蛋白高表达率高于质地硬的肿瘤。而本课题组前期研究证实肿瘤质地是影响患者术后PFS的潜在风险因素，质地软的肿瘤患者PFS较质地硬的肿瘤患者更长[21]，其原因可能是质地软的肿瘤中PTEN蛋白高表达，导致肿瘤增殖较质地硬的肿瘤慢而PFS延长。不同质地肿瘤中PTEN蛋白表达差异的原因可能是质地软的肿瘤中PTEN蛋白高表达，对周围骨质侵袭性高，肿瘤内骨质侵袭完全而肿瘤质地软；而质地硬的肿瘤中PTEN蛋白表达水平低，对周围骨质的侵袭性弱，骨质破坏不全导致肿瘤内部骨性成分多而质地偏硬。

另外，PTEN蛋白低表达可促进肿瘤细胞增殖。Yang等[18]对脊柱脊索瘤中PTEN表达的研究发现，PTEN低表达患者术后PFS和生存期均显著缩短。Lee等[14]发现脊索瘤中PTEN杂合性缺失导致PTEN肿瘤抑制作用下降，而细胞增殖加快。本研究结果与上述研究结果一致，颅底脊索瘤PTEN蛋白低表达者PFS显著缩短，术后肿瘤进展风险增加，即PTEN在颅底脊索瘤中的表达降低可能促进肿瘤细胞增殖。关于PTEN抑制脊索瘤细胞增殖的分子机制较少见报道，Michmerhuizen等[22]研究发现，PI3K/Akt/mTOR通路抑制剂可抑制细胞生长、增殖并促进其凋亡，而PTEN是针对该通路的抑癌基因，由此推断，颅底脊索瘤中PTEN低表达可降低对PI3K/Akt/mTOR通路的抑制作用，减弱对细胞生长、增殖的抑制作用、减少凋亡，进而加速肿瘤进展。

本研究结果表明，PTEN蛋白在颅底脊索瘤中的表达与肿瘤骨质侵袭性、质地及肿瘤进展相关，而骨质侵袭性、肿瘤进展是颅底脊索瘤的重要特性，因此进一步研究PTEN在颅底脊索瘤中发挥作用的分子机制具有重要临床意义。但本研究也存在不足之处，纳入例数较少，PTEN在颅底脊索瘤中更多的作用及相关机制仍需进一步探讨。

综上所述，非骨质侵袭肿瘤中PTEN蛋白高表达率低，质地软的肿瘤PTEN蛋白高表达率高，PTEN蛋白低表达的颅底脊索瘤患者PFS显著缩短。