牙本质脱矿方法和药物的体外研究进展

付玉琴，张石楠，刘波，吕长海，李晓丽，刘娟

(昆明医科大学附属口腔医院a.儿童口腔科； b.口腔预防科，昆明 650106)

牙本质是牙齿的重要组成部分，也是牙齿承担外界应力以及预防牙髓组织感染的重要结构。当龋病累及牙本质时，在细菌及其毒素产生的低pH环境下，牙本质羟基磷灰石中的钙、磷等无机成分持续脱矿，管间牙本质和管周牙本质因脱矿而表面粗糙，牙本质小管开放[1]，细菌及其代谢产物可经开放的小管或粗糙的孔隙感染牙髓，并逐渐侵犯根部牙本质。临床上，树脂充填龋洞前，必须对牙本质行酸蚀粘接剂处理，以去除玷污层或改善牙本质界面的形态，以利于修复体形成良好固位；而清除根管内壁感染牙本质是根管消毒的要求之一，也是根管治疗成功的保证。此外，疏通钙化根管是临床根管治疗的常见步骤。因此，在大部分牙体疾病的发病、治疗、预后中，牙本质中的矿物质均参与其中。对牙本质病理性脱矿机制的研究有助于阐述疾病病理，对症下药；而对各类药物脱矿疗效的研究则有助于寻找更好的治疗方式。由于受临床研究局限性的影响，大多数学者采用体外研究的方式对牙本质病理变化及药物疗效进行研究。现对目前体外构建牙本质脱矿模型的方法及牙体疾病治疗过程中脱矿药物的研究现状予以综述，以期为相关临床及科研工作提供帮助。

1 牙本质脱矿方法

龋病生成的四联因素理论认为，龋病所致的牙体组织产生机械、理化性质改变由致龋菌、食物、宿主和时间4种因素共同作用导致。牙本质脱矿方法通过模拟牙本质龋生成的条件建立体外牙本质龋脱矿模型，包括模拟主要的牙本质龋生成因素，如致龋微生物及微生物生成的有机酸、口腔唾液环境及随进食产生的pH值改变等，并分析各种脱矿方法与自然牙本质龋损在物理、机械、化学性质等方面的差异。

1.1微生物脱矿法 微生物脱矿法利用主要致龋菌及其代谢产物对牙本质的作用，使牙本质表面发生脱矿及胶原降解等病理改变[2]，其病理结构与自然形成的牙本质龋高度相似。通常将体外培养的1种或几种主要致龋菌接种到样本表面，或将样本浸泡于菌液中，经过一段时间的恒温换液培养后，检测其性质的改变[3]。Marquezan等[4]认为，微生物使临床建议保留的牙本质脱矿层转变为软化牙本质，使胶原降解、脱矿牙本质表层柔软，形成类似细菌感染层的结构。脱矿牙本质的病理结构分为大量脱矿的病损体部及表面的透光区两部分，与自然牙本质龋的不规则形态类似[5]。除无反应性牙本质生成外，微生物脱矿法模拟的牙本质龋的性状更接近自然牙本质龋的表现。

正常牙本质的粘接性与牙本质龋脱矿层的粘接性不同。微生物的作用对粘接剂粘接性的影响尚无确切定论[5-6]。研究证实，致龋微生物在体外可短期内生成标准牙本质龋模型[7]。因此，微生物脱矿模型对于研究各类粘接剂的真实粘接效果、促进粘接剂改良具有重要意义。此外，常应用微生物脱矿法评估修复材料的疗效[8]。随着培养基中营养物质的消耗，细菌活性将发生改变，故难以长时间维持固定的pH值，常规微生物脱矿模型采用定量、定期更换培养液的方式手动调节pH值。为了更真实地模拟口内环境的牙本质龋，有学者采用计算机控制的连续微生物培养模型，以动态而精细地调控细菌生长环境，同时采用人造口腔模拟牙本质的咀嚼负荷，营造高度近似口腔生理环境的致龋环境[9]，此方法对于阐述龋病发生发展的病理机制具有重要意义，可能是未来牙本质龋及其脱矿模型的发展方向，但由于步骤繁琐、设备昂贵、用时较长，且存在细菌污染的可能，目前并不常用。

1.2化学脱矿法 化学脱矿法利用致龋菌生成的有机酸产物在牙本质的作用研究其对羟基磷灰石的溶解脱矿作用。化学脱矿法所用溶液由各种含或不含钙、磷等物质的低pH值有机酸或有机酸盐组成，模拟牙体脱矿时的口腔内酸性环境。

1.2.1静态脱矿液脱矿法 致龋菌生成的产物主要为乙酸或乳酸，可溶解羟基磷灰石，使牙本质脱矿。因此，含乙酸或乳酸的脱矿液是人造牙本质化学脱矿模型的常用成分[10]。Joves等[11]通过比较乳酸脱矿液形成的牙本质龋结构与正常牙本质、自然形成牙本质龋的不同，探讨乳酸脱矿液模拟人体自然脱矿的可行性及局限性，扫描电镜结果显示，在自然形成牙本质龋表面和乳酸脱矿牙本质表面存在结构差异，前者牙本质小管闭塞，存在较厚的表面玷污层，管间牙本质胶原纤维被矿物质晶体包裹；后者牙本质小管开放，表面玷污层较薄，管间牙本质胶原纤维暴露；进一步检测显示，两种牙本质的不同深度的矿物质密度及其对粘接界面微拉伸机械强度的影响相似，证实了采用乳酸脱矿液模拟自然形成牙本质龋并研究牙本质脱矿界面粘接性能的可行性。

除乳酸脱矿作用外，自然形成牙本质龋还受到甲酸、乙酸及各类胶原酶等的作用，故相同牙本质深度的牙本质矿物质含量、显微硬度值低于乙酸或乳酸脱矿液形成的脱矿牙本质，但在牙本质表层至其下130 μm范围内，两者的差异无统计学意义；随着检测深度的增加，乙酸作用牙本质硬度值的变化模式仍与自然脱矿牙本质类似，故认为乙酸脱矿7 d可高度模拟牙本质表层至其下130 μm内的自然牙本质龋脱矿层[11-12]。经相同pH值乙酸及乳酸脱矿液作用的正常牙本质，与14 d组相比，7 d组在最终脱矿深度更高，但两者矿物质密度的变化模式相同[13]。牙本质脱矿深度及硬度随作用时间延长而增加，脱矿达一定深度后逐渐与正常牙本质值接近[2,4]。但由于静态环境中pH值的升高及作用时间有限[14]，乙酸或乳酸形成的脱矿深度均较浅。Marquezan等[4]比较更长作用时间下乙酸与乳酸的脱矿效果发现，前期乙酸脱矿速率较快，但最终脱矿深度及总脱矿量不及乳酸，可能由于乙酸扩散的动力学效果更好，因而前期扩散速度及脱矿速率较快；而乳酸对管周牙本质的矿物质溶解效果更明显，胶原纤维暴露量更多[15]，同时具有激活牙本质中组织蛋白酶K、促进胶原降解的作用[16]，后期更有利于渗透入深层牙本质中；且乳酸解离平衡常数低于乙酸，因此脱矿潜力更大[17]。综上所述，含乙酸和乳酸的脱矿液是进行静态牙本质龋模拟比较理想的材料。目前已被应用于化学模拟牙本质龋，并在脱矿牙本质再矿化治疗、牙本质粘接及修复的研究中具有较好的应用适应性。但短期内模拟牙本质龋脱矿浅层的研究更倾向于选择含乙酸的脱矿液；若需获得更高的脱矿深度，则倾向于选择乳酸脱矿法。

1.2.2动态pH循环脱矿法 pH循环脱矿法利用不同pH值、不同矿物质组成的脱矿液、再矿化液的循环作用建立牙本质脱矿模型，以模拟人体反复进食后产生的口腔动态pH环境改变，其中脱矿液一般为酸性乙酸缓冲液，再矿化液为中性磷酸盐缓冲溶液。与静态模拟法不同，pH循环脱矿法在脱矿液作用间歇使用中性缓冲液，故产生相同脱矿深度的作用时间更长。Lenzi等[18]的研究发现，pH循环脱矿法作用14 d后，乳牙或恒牙牙本质表面下15～250 μm内的平均努氏显微硬度值较相应自然脱矿牙本质低，但两者比较差异无统计学意义，故推断pH循环脱矿法可用于模拟乳、恒牙牙本质龋。Marquezan等[4]横向比较10～500 μm内不同横截面显微硬度值发现，pH循环组脱矿牙本质显微硬度值在牙本质表面下40 μm内的变化均与自然脱矿组相似；但其牙本质表面下40 μm以下的显微硬度值逐渐升高，且均高于自然脱矿牙本质，因此该动态脱矿法可模拟短时间内生成的较浅牙本质脱矿层；而pH循环组与乳酸凝胶组的比较表明，pH循环法产生的脱矿层更深，与自然脱矿层显微硬度值更加接近。目前pH循环脱矿法不仅用于再矿化治疗中牙本质浅层的脱矿模拟[19]，也用于体外模拟口腔动态pH环境下各种再矿化治疗药物的抗继发龋效果[20]及修复体微渗漏的研究[21]。

Sung等[22]研究发现，化学脱矿法、微生物培养法均能产生与自然形成牙本质龋脱矿层相似的结构改变，且余留牙体钙/磷比值无差异，钙、磷损失量由大到小依次为化学脱矿法、微生物培养法、自然形成牙本质龋，而微生物培养法受累范围更广。研究表明，脱矿方法可能对牙本质粘接或修复的研究结果产生影响[8,23]。在模拟自然脱矿牙本质龋时，根据研究目的，微生物脱矿法更适宜于模拟带有细菌侵入层、脱矿层的牙本质龋结构，可模拟深层牙本质的脱矿。一些学者也用这种方法检测氟预防原发龋或继发龋的作用[24]。

2 牙本质脱矿药物

在牙本质粘接系统、根管治疗过程中，脱矿效果是评价药物对牙本质表面玷污层的清理、改性及钙化根管疏通疗效的重要内容[25]。

2.1一元酸脱矿药物 牙本质粘接系统中常用的磷酸酸蚀剂对牙髓神经末梢刺激较大，作用后牙本质开放程度较高，粘接剂不能有效封闭牙本质小管，导致术后牙本质敏感性较高[26]，因而近年来学者们致力于寻找既能改善牙本质粘接术后敏感性，又能提高粘接效果的方法。其中含弱酸性有机酸的自酸蚀粘接剂改良是研究的热点。利用自酸蚀粘接剂(OptiBond All-In-One一步法粘接剂中加入乙酸成分)的酸蚀作用对牙本质进行浅层脱矿，以改善传统自酸蚀粘接剂的粘接性能。研究表明，pH值为2的温和自酸蚀粘接系统仅形成表层脱矿，更利于粘接[27]。而两步法自酸蚀粘接剂的粘接强度高于一步法自酸蚀粘接剂，可有效防止微渗漏[28]。因此，自酸蚀粘接系统更适宜于牙本质粘接。

2.2二元酸脱矿药物 二元酸脱矿药物主要包括马来酸、酒石酸、苹果酸和乙二酸(即草酸)。研究发现，与乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)相比，7%马来酸处理牙本质的钙释出量比较差异无统计学意义，磷、氧释出量增加，而碳释出量减少[29]。沈晴昳等[30]的体外研究显示，15%酒石酸处理牙本质60 s后，牙本质小管开口明显扩大，与传统磷酸酸蚀15 s后的牙本质小管的直径相当；苹果酸作用后牙本质小管的开放程度最低。除上述二元酸外，乙二酸可通过较强的化学结合键黏附于羟基磷灰石，形成新的钙盐产物，而该钙盐产物不易被酸溶解，故钙流失极少，同时，乙二酸的化学结合键结合强度高于乳酸、柠檬酸和马来酸及其他有机酸，使其在降低牙本质粘接术后敏感性方面具有较好的应用优势，是修复粘接前预处理的潜在制剂之一[31]；马来酸、柠檬酸和乳酸与羟基磷灰石黏附后生成相应的钙盐沉淀，并易溶于各自的酸性溶液中，经超声清洗后，牙本质将发生显著脱矿[32]。上述二元酸的酸性显著低于磷酸，对牙髓组织的刺激较弱，可用于新型牙本质粘接系统的研发，如第6代粘接系统Contax中加入马来酸，其粘接强度与第7代粘接系统Clearfil S3相近[33]。可见，粘接系统的改良可以从添加二元酸脱矿药物的成分考虑。

2.3三元酸脱矿药物 主要的三元羧酸为柠檬酸及其混合物。Marshall等[34]认为，柠檬酸对管周牙本质和管间牙本质的脱矿作用随时间呈线性改变；柠檬酸浓度越高，脱矿越快；但作用一段时间后，管间牙本质脱矿速率减慢，与磷酸的脱矿改变模式类似，除2 mol/L柠檬酸浓度组外，其余各组均在短时间内出现稳定的平台期，平台期内管间牙本质脱矿速率不随脱矿深度的增加而改变；不同磷酸浓度对浅层或深层管周牙本质的脱矿速率无显著影响，但pH值降低能显著改变脱矿速率，柠檬酸脱矿速率受pH值影响的改变更加明显。Gandolfi等[35]的研究表明，10%柠檬酸与10%EDTA 1 min的牙本质脱矿能力相同；经处理的牙本质表面的牙本质完全开放，无玷污层或牙本质碎屑，管周牙本质排列紧密而均匀；作用1 min后，羟基磷灰石与Ⅱ型氨基酸的比值降低，脱矿明显。

基于柠檬酸盐的脱矿作用，由柠檬酸、多西环素、去污剂组成的混合溶液——MTAD(mixture of tetracycline isomer,an acid and detergent)与抗菌药物及去污剂同时作用能够去除玷污层、脱矿根管壁，起到强力清理根管壁的作用。Kumar等[36]的研究表明，MTAD是具有应用潜力的根管冲洗液，并不会改变牙本质小管的结构。经柠檬酸脱矿牙本质的内部转化生长因子易被激活，可吸引牙髓干细胞聚集、存活及修复，从而调控修复性牙本质的生成[37]。

2.4多元酸脱矿药物

2.4.1EDTA及其混合物脱矿药物 EDTA是常用的根管预备制剂，利用螯合作用结合牙本质中的钙离子使之脱矿。体外研究表明，EDTA可导致根管壁牙本质超微结构及成分的改变，主要表现为钙、磷的流失和牙本质胶原纤维的暴露；而EDTA浓度越高，牙本质中磷酸盐流失越多，胶原暴露量越大[38]。Scelza等[39]比较17% EDTA与10%柠檬酸对30岁以下或60岁以上人群前磨牙根的脱矿作用发现，4组牙本质小管的开放数量比较差异无统计学意义；17% EDTA使60岁以上人群牙本质小管的开放直径增大；10%柠檬酸对牙本质小管直径的改变无年龄差异，故EDTA在老年人群钙化根管疏通方面具有优势。有学者认为，17% EDTA作用60～90 s能形成较好的利于粘接的预处理表层[40]。张彦[41]的研究表明，EDTA作用72 h时，牙本质中矿物质大量流失；作用168 h后，根管中上段牙本质内壁下深度550 μm内的牙本质显微硬度显著降低，且牙本质显微硬度随EDTA浓度的升高而明显降低；余留牙本质的钙/磷比保持不变。Schwendicke等[42]使用17%中性EDTA溶液作用于脱矿牙本质96 h后，牙本质中的矿物质迅速流失，并形成深度约700 μm的脱矿层，其脱矿程度高于乙酸及乳酸脱矿法、pH循环脱矿法、细菌培养脱矿法及自然脱矿形成的牙本质脱矿层。Ghisi等[43]的扫描电镜结果显示，EDTA使牙本质脱矿的同时并不破坏有机质，只有联合使用次氯酸钠时才会发生牙本质侵蚀和牙本质小管开放。Prasad和Donoghue[44]比较EDTA、8%和10%的硝酸、8%和10%的甲酸、Perenyi液体(硝酸和铬酸的乙醇混合液)对大鼠下颌骨和牙的脱钙作用发现，EDTA脱钙时间最长，但对牙本质小管中的细胞、空泡变、磨损程度最低，几乎可以忽略不计；而8%与10%的硝酸脱钙最快，但与EDTA组相比，8%牙硝酸组的牙本质破坏程度降低，8%牙硝酸组的牙本质破坏程度加重；8%与10%的甲酸脱钙速率仅次于EDTA组，且其牙本质破坏程度分别与8%、10%的硝酸相当；而Perenyi液体的牙本质破坏程度最重；故认为EDTA和8%的硝酸较易获得符合生理学要求的脱钙染色切片，在时间允许的条件下，EDTA是制作牙本质脱钙染色切片的理想制剂之一。EDTA是最温和的脱钙预处理剂，还可作为制作病理切片的脱钙液。另有研究认为，除1% EDTA外，经10%、17% EDTA脱矿的牙本质基质发生了胶原重排[35]，但内源性蛋白酶的活性未改变[45]，故可用于制备具有酶活性的脱矿牙本质基质。

由EDTA与氯己定、表面活性剂组成的混合液QMix也被用作根管冲洗液。比较EDTA、马来酸、QMix的根管壁脱矿作用发现，QMix使牙本质释放出的钙元素多于EDTA、马来酸，但牙本质碳元素的减少量低于EDTA[22]，可能是表面活性剂提高了QMix的渗透力，使QMix具有更强的脱矿作用；氯己定对内源性蛋白酶产生的抑制作用，使胶原溶解减少、碳元素流失降低[46]。另有研究指出，17% EDTA在根尖处的玷污层效果不如QMix与MTAD，认为EDTA对羟基磷灰石有一定的作用效果，也通过作用于牙本质中非胶原蛋白而发挥疗效，而根尖处非胶原蛋白含量较少，因而去除牙本质玷污层的疗效减弱；而QMix在根管上中下三段的玷污层清理效果均较好，与MTAD的作用效果类似[47]，即使联合次氯酸钠溶液，也不会对牙本质胶原蛋白形态产生明显改变，脱矿的同时也并不改变牙本质的无机结构，在保持牙本质的有机和无机成分方面具有较好的特性；EDTA不改变牙本质的胶原蛋白结构，但可改变其无机结构，故QMix被认为是比EDTA更好的根管冲洗液[48]。

2.4.2含酸性基团的功能性单体脱矿药物 自酸蚀处理剂中的功能性单体含有酸性基团，通过黏附-脱钙作用与钙离子结合，形成钙-单体复合物，从而与羟基磷灰石建立非常稳定的化学结合，改性玷污层；同时促进树脂单体渗透性，形成树脂突进行机械固位[32]。Mai等[49]使用不同分子大小的聚丙烯酸钠盐处理牙本质，与10%磷酸脱矿组相比，能更好地保持脱矿牙本质的机械性能，却未改变湿粘接或干粘接后的微拉伸机械强度。Wang等[50]的研究证实，含有磷酸甘油二甲基丙烯酸酯单体的自酸蚀粘接剂的脱矿作用最显著，乙醇擦拭后牙本质小管呈开放状态，并形成最长的树脂突，即刻微拉伸机械强度最高，但难以长时间保持，远期受热循环作用，其而微拉伸机械强度降低，形成纳米渗漏。而含有10-甲基丙烯酸氧癸基磷酸二氢酯单体组分的粘接剂形成的1 μm短树脂突能很好地黏附于处理面，热循环对其耐久度影响也较小。6-甲基丙烯酰氧基己基磷酸二氢盐易被酒精去除，亲水性不如10-甲基丙烯酸氧癸基磷酸二氢酯，形成的亲水性单体-钙结合物连接强度较低，远期修复效果不佳[50]。

孙静晴[51]通过原子力显微镜观察37%磷酸、Superbond C&B两种全酸蚀系统以及Clearfil SE Bond、iBond两种自酸蚀系统，结果显示，两种全酸蚀系统的脱矿深度明显大于两种自酸蚀系统，其中iBond脱矿深度明显高于Clearfil SE Bond；全酸蚀系统组几乎无完整的管周牙本质，且胶原纤维网失水塌陷较多，而自酸蚀系统对管周牙本质的破坏相对较少，但自酸蚀粘接剂中单体的水解稳定性较差，易发生微渗漏。研究表明，联合次氯酸钠行有机物降解可提高自酸蚀单体的粘接强度，降低纳米渗透发生率[52]。

2.5其他 除上述制剂外，某些有机提取物也具有脱矿功能，并可同时改善牙本质的粘接效果。植物提取物肌醇六磷酸具有脱矿酸蚀作用，Kong等[53]研究显示，与EDTA、磷酸相比，粘接界面微拉伸强度高，可更好地防止胶原破坏，其纳米渗透性低。壳聚糖除具有与EDTA相似的脱矿能力外[54]，还对内源性蛋白酶具有直接抑制作用，其细胞毒性作用24 h后即消失，且其内源性蛋白酶抑制作用和细胞毒性作用均与EDTA类似[55]。Gu等[56]的研究显示，1%脱乙酰壳聚糖在溶解胶原外矿物质的同时保持了胶原内的矿物质，降低了内源性蛋白酶的胶原降解，处理60 s不会对粘接强度产生影响，故可作为粘接前预处理剂。有研究显示，壳聚糖在根尖1/3处也能发挥较好的脱矿渗透作用，且去除玷污层的效果强于MTAD[57]。因此，含有上述配方的制剂可能是未来根管冲洗液研究的新方向。

3 小 结

牙本质脱矿方法多样，不同牙本质脱矿药物的作用效果也不同。目前，羟基磷灰石溶解脱矿的机制尚不明确[58]，未能完美模拟牙本质脱矿条件的复杂性，也未能实现对牙本质脱矿深度的精准调控，上述内容是未来牙本质脱矿方法改良的重点之一。除脱矿效果外，还应更加注重牙本质粘接修复及根管冲洗药物的脱矿界面杂化层机械强度、老化及其对充填材料微渗漏或留存率等方面的影响。研发兼具浅层脱矿与抑制胶原降解或促进脱矿界面未结合区域再矿化效果的简易操作混合粘接剂或根管冲洗液是牙本质脱矿药物的发展方向[59]。采用计算机控制系统对人工口腔的精确动态调控尚需更多的研究和改进，以降低成本。新型酸蚀粘接药物、根管治疗药物逐渐趋向更具有生物安全性的天然提取物。