右美托咪定对咪达唑仑麻醉所致认知功能障碍的保护作用及其机制研究

董浩垚，侯俊德，迟晓慧，王晓微，赵广平，陈永学

(1.河北工程大学医学院，河北 邯郸 056008； 2.邯郸市中心医院麻醉科，河北 邯郸 056008)

术后认知功能障碍是患者在手术及麻醉后出现的记忆力减退、判断和解决问题能力降低、注意力难以集中等以认知功能缺失为主的神经系统并发症，轻者仅影响认知功能及情绪，严重者可丧失独立自主能力[1]。相关研究显示，高达60%的心脏、骨科等大手术患者及25.8%的非心脏等手术患者可于术后1周内发生认知功能障碍[2]。近年来随着研究的不断深入，部分学者发现停止注射全身麻醉药物后，麻醉效果虽能在短时间内消除，但对大脑造成的形态学及功能改变在短期内无法修复，大部分麻醉药物可通过影响中枢神经系统不同作用区域而影响认知功能，导致短期内学习及记忆能力降低以及逆行性或顺行性遗忘等不良反应[3-4]。周彤[5]研究显示，咪达唑仑可通过抑制海马CA1区突触长时程增强和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ蛋白的表达影响学习记忆能力；而覃思平等[6]研究显示，右美托咪定可通过抑制核因子κB通路多种相关因子的表达而降低海马区炎症反应程度，进而对认知功能起到保护作用。本研究主要探讨右美托咪定对咪达唑仑麻醉所致认知障碍的保护作用及其部分作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 120只无特定病原体级成年雄性SD大鼠，8～10周龄，体重250～350 g，由河北省实验动物中心提供，使用许可证号：SYXK(冀)2018-0008，适应性饲养1周，自由进食水。本研究获得实验动物伦理委员会批准，符合动物实验的伦理学要求。

1.1.2试剂与仪器 盐酸右美托咪定注射液(批号：20190601)、咪达唑仑注射液(批号：20191203)(江苏恩华药业股份有限公司)；蛋白裂解液及酶联免疫吸附试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,批号：20191017)；Morris水迷宫(上海软隆科技发展有限公司)；高速低温离心机(CR-GIII/CR22N)(日本Hitachi公司)；酶标仪(Epoch)(美国Hologic公司)；电泳仪(EPS-300)(上海天能科技有限公司)；全自动凝胶成像系统(ZF-258)(上海嘉鹏科技有限公司)；化学发光成像系统(ChemiScope 6000)(上海勤翔科学仪器有限公司)。

1.2模型建立及分组 将120只大鼠按照随机数字法分为正常对照组、咪达唑仑组、右美托咪定50 μg/kg组、右美托咪定75 μg/kg组，各30只，每组大鼠随机分为2个亚组，分别进行Morris水迷宫实验(15只)与蛋白含量检测(15只)。正常对照组大鼠正常进食水，不给予任何药物处理；咪达唑仑组大鼠腹腔注射50 mg/kg咪达唑仑诱导麻醉，并于翻正反射开始恢复时追加首剂量的50%，维持麻醉2 h，期间保证大鼠自主呼吸，注意保暖；右美托咪定50、75 μg/kg组腹腔注射50 mg/kg咪达唑仑诱导麻醉，并于翻正反射开始恢复时追加首剂量的50%，维持麻醉2 h，麻醉结束前30 min腹腔分别注射50、75 μg/kg右美托咪定，期间保证大鼠自主呼吸，注意保暖。每组大鼠每日麻醉1次，连续麻醉7 d。以大鼠前爪不能自行翻转为俯卧位且维持时间10 s以上作为大鼠前爪翻正反射消失标准，即麻醉起效，造模成功，本研究大鼠均造模成功。

1.3Morris水迷宫实验检测学习及记忆能力 将水迷宫置于光线较暗的安静房间内，水池分为4个象限，每个象限各挂一个独特的指示标志物；水中加入适量碳染黑剂，使水变成不透明黑色；第三象限中央放置平台，且平台低于水面2 cm；每次实验前先将水池内的水加热至24 ℃左右。实验前1天，将大鼠放于水池内适应性游泳3～5 min；然后分别于麻醉第1、3、5、7天待大鼠麻醉清醒后行定位航行实验测定大鼠学习能力，麻醉第7天行空间探索实验测定记忆能力。

定位航行：分别从4个象限相同位置将大鼠面朝池壁放入水中，记录大鼠登上隐蔽平台所用时间(即逃避潜伏期)，并让大鼠在平台上停留15 s(若120 s内没有找到平台，由研究人员协助其找到平台，将所用时间记为120 s)，4次时间的均值作为当天成绩。

空间探索：水池内平台撤除，自距离第三象限最远的象限，即第一象限内在原池壁位置将大鼠面朝池壁放入水中，记录120 s内大鼠穿越原第三象限平台位置次数以及在第三象限的停留时间，计算在第三象限停留比率。

1.4Western Blot法检测磷酸化胞外信号调节激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2，p-ERK1/2)、磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(phosphorylated cAMP response element binding protein,p-CREB)水平 分别于麻醉第3、5、7天各组随机选取5只大鼠断头处死后，自锥孔开始用手术剪纵向剪开头盖骨，并应用齿镊进行剥离，暴露脑组织；继而用低温0.9%氯化钠溶液冲洗后，将脑组织取出，并迅速在冰上分离海马组织，置入灭菌冻存管内标记，液氮冰冻后-80 ℃冰箱保存。称取20 mg海马组织标本，加入200 μL裂解液裂解，匀浆器充分研磨，4 ℃环境下12 000×g离心5 min，提取总蛋白，二辛可宁酸法测定总蛋白浓度；取蛋白上样行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚偏氟乙烯转膜、5%脱脂奶粉封闭后，分别加入p-ERK1/2、p-CREB一抗4 ℃孵育过夜；封闭-洗涤缓冲液洗涤3次，加入二抗，室温孵育2 h；封闭-洗涤缓冲液洗涤3次，电化学发光显影；Image J图像分析软件检测蛋白条带灰度值。

2 结 果

2.1各组大鼠不同时点间逃避潜伏期比较 麻醉第1、3、5、7天大鼠逃避潜伏期的主效应差异有统计学意义(P<0.01)；不考虑测量时间，各组间逃避潜伏期的主效应差异有统计学意义(P<0.01)；组间和时点间存在交互作用(P<0.01)，麻醉第3、5、7天各组大鼠逃避潜伏期呈下降趋势，咪达唑仑组、右美托咪定50 mg/kg组、右美托咪定75 mg/kg组逃避潜伏期均长于正常对照组，右美托咪定50 mg/kg组和右美托咪定75 mg/kg组均短于咪达唑仑组，右美托咪定75 mg/kg组短于右美托咪定50 mg/kg组(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠不同时点间逃避潜伏期比较

2.2各组大鼠越台位次数及停留比率比较 麻醉第7天各组大鼠穿越平台位置次数及停留在第三象限时间比率比较差异有统计学意义(P<0.01)，咪达唑仑组、右美托咪定50 mg/kg组、右美托咪定75 mg/kg组越台位次数少于正常对照组，右美托咪定50 mg/kg组和右美托咪定75 mg/kg多于咪达唑仑组，右美托咪定75 mg/kg组多于右美托咪定50 mg/kg组(P<0.05)；咪达唑仑组、右美托咪定50 mg/kg组、右美托咪定75 mg/kg组停留比率低于正常对照组，右美托咪定50 mg/kg组和右美托咪定75 mg/kg高于咪达唑仑组，右美托咪定75 mg/kg组高于右美托咪定50 mg/kg组(P<0.05)。见表2。

2.3各组大鼠p-ERK1/2、p-CREB蛋白表达水平比较 麻醉第3、5、7天各组大鼠p-ERK1/2、p-CREB蛋白表达水平比较差异有统计学意义(P<0.01)，咪达唑仑组、右美托咪定50 mg/kg组、右美托咪定75 mg/kg组p-ERK1/2、p-CREB蛋白表达水平低于正常对照组，右美托咪定50 mg/kg组和右美托咪定75 mg/kg高于咪达唑仑组，右美托咪定75 mg/kg组高于右美托咪定50 mg/kg组(P<0.05)，见表3、图1。

表3 各组大鼠p-ERK1/2、p-CREB蛋白表达水平比较

3 讨 论

学习记忆能力是大脑最重要的生理功能，是人类工作、生活等活动及生存最基本的技能，也是认知功能最主要的表现形式[7-8]。研究证实，中枢神经系统与信息传递效率相关的突触功能及与信息储存相关的突触结构的高度可塑性是学习和记忆功能最主要的生理学基础，改变突触可塑性可影响学习记忆功能[9]，且海马是执行学习及记忆功能的重要部位，不仅参与陈述性记忆，还涉及认知功能和位置导航，在讯息的空间储存和处理中具有重要作用[10]。部分研究证实，多种麻醉药物可通过调控p-ERK及环腺苷酸/蛋白激酶A-CREB-脑源性神经营养因子通路活性而影响认知功能[11-12]。

p-ERK1/2：磷酸化胞外信号调节激酶1/2；p-CREB：磷酸化cAMP反应元件结合蛋白

综上所述，右美托咪定可改善咪达唑仑引起的大鼠认知功能损害症状，其作用机制可能是通过调节环腺苷酸/蛋白激酶A-CREB-脑源性神经营养因子信号通路中p-ERK1/2及p-CREB等的表达保护大鼠认知功能。