慢性乙型肝炎肝纤维化患者外周血单个核细胞中TET3水平与纤维化程度的关系

安红杰 耿 华 葛志胜 徐金凤 何文艳 赵崇山 高美丽 陈俊红

慢性乙型肝炎(CHB)患者随病程进展多伴有肝纤维化[1]。肝纤维化是CHB病程进展的重要病理过程，若不及时进行干预，易发展为肝硬化，甚至肝细胞癌[2]。中国每年约有60万人因CHB肝硬化及肝细胞癌死亡[3]。探究肝纤维化的发病及进展机制对于抑制肝纤维化进展尤为重要。已有多项研究表明肝纤维化与肝星状细胞激活有关[4-6]。HBV诱发肝损伤可激活肝星状细胞，增加细胞外基质分泌，还可诱使活化的肝星状细胞转化为成纤维细胞，导致肝纤维化发生及进展。早期了解肝纤维化程度并及时进行干预可有效抑制肝纤维化进展[7-9]。目前，肝穿刺活组织检查是确诊肝纤维化程度的金标准[10]，但由于其为有创伤性检查，且检查耗时较长，不利于临床广泛应用。因此，需探究便利、准确的生物标志物或检查手段以评估肝纤维化程度。

10-11转位酶3(TET3)是一种DNA去甲基化酶，可将5-甲基胞嘧啶氧化为5-羟甲基胞嘧啶[11]。有研究表明，TET3可靶向长链非编码RNA HIF1A-AS1介导肝星状细胞活化[12]；此外，TET3/转化生长因子-β1(TGF-β1)的正反馈回路可促进肝纤维化进展[13]。由此推测TET3参与了肝纤维化的进展过程，其表达水平与肝纤维化程度有关。外周血单个核细胞可反映肝纤维化程度，且在外周血中含量较高，易于采集[14]。本文探究了CHB肝纤维化患者外周血单个核细胞中TET3水平与肝纤维化程度的关系，以期为评估肝纤维化程度提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年9月至2019年12月在河北中石油中心医院确诊的137例CHB肝纤维化患者作为研究对象。根据《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[14]诊断CHB。纳入标准：(1)接受肝穿刺活组织病理检查，并诊断为肝纤维化；(2)未接受抗病毒和抗纤维化治疗；(3)能够配合完成相关检查；(4)签署了知情同意书。排除标准：(1)合并自身免疫性肝炎、慢性丙型肝炎、酒精性肝炎或非酒精性脂肪性肝病等；(2)合并肝细胞癌；(3)除HBV感染之外，合并其他严重感染性疾病。137例CHB肝纤维化患者中男性85例，女性52例，年龄20～66岁，平均年龄为(45.78±11.02)岁；其中S1期28例，S2期36例，S3期30例，S4期43例。本研究经医院医学伦理委员会批准(批件号KYLL-2019-06)。

1.2 临床信息收集及处理

收集年龄、性别等信息，使用7600型全自动生化分析仪(日本日立公司)检测肝穿刺活组织检查前1日或当日AST和ALT水平，使用DxH 600血细胞分析仪[贝克曼库尔特实验系统(苏州)有限公司]检测血小板(PLT)水平。计算AST/PLT比值指数(APRI)和肝纤维化指数(FIB-4)，APRI=AST(/正常值上限，U/L)/PLT(×109/L)×100，FIB-4=年龄×AST(U/L)/[PLT(×109/L)×ALT(U/L)1/2]。

1.3 肝纤维化程度判断

超声引导下将活组织穿刺针插入CHB肝纤维化患者肝部，取出约2 cm的肝组织，由本院病理科2名副主任医师评估肝纤维化程度。肝纤维化程度分为S1期、S2期、S3期和S4期。S1期 汇管区肝纤维化扩大，局限窦周或肝小叶内纤维化；S2期 肝汇管区周围纤维化，纤维间隔形成，但肝小叶结构保留；S3期 纤维间隔及肝小叶结构紊乱，但未进展至肝硬化；S4期 肝硬化[14]。

1.4 外周血单个核细胞中TET3表达水平检测

抽取CHB肝纤维化患者肝穿刺活组织检查前1日或当日的空腹肘部静脉血10 mL，采用密度梯度离心法提取外周血中单个核细胞[15]。步骤如下：25 ℃ 800 r/min离心15 min，离心半径为8 cm，取离心后下层血细胞，置入10 mL Ficoll分离液中，提取外周血单个核细胞。

采用蛋白质印迹法检测单个核细胞中TET3的表达水平[16]。步骤如下：取上述实验获取的外周血单个核细胞，滴加RIPA裂解液至装有单个核细胞的试管中，裂解细胞，获取总蛋白，然后使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白质定量。80 V凝胶电泳15 min，然后加压至120 V，直至溴酚蓝跑出胶面，转膜，然后用5%脱脂奶粉封闭2 h，滴加兔抗人TET3单克隆抗体，4 ℃孵育过夜，滴加二抗，室温下孵育2 h。采用电化学发光法(ELC)曝光显影。应用ImageJ 1.8.0软件读取蛋白质印迹实验的条带灰度值。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组基本资料比较

S1期、S2～S3期和S4期患者在年龄、性别方面比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)；在AST、ALT、PLT、APRI指数和FIB-4指数方面比较，3组间差异均有统计学意义(P均<0.05)。S4期AST水平、APRI指数和FIB-4指数均高于S1期和S2～S3期，差异均有统计学意义(P均<0.05)。S4期ALT水平高于S1期，PLT水平低于S1期，差异均有统计学意义(P均<0.05)。S2～S3期AST、ALT和APRI指数均高于S1期，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 各组基本资料比较

2.2 各组TET3水平比较

S1期、S2～S3期和S4期外周血单个核细胞中TET3水平分别为2.17±0.71、3.39±1.18和5.75±1.40，3组间比较差异有统计学意义(F=89.023，P<0.001)。S4期外周血单个核细胞中TET3水平高于S1期和S2～S3期，差异均有统计学意义(P均<0.05)。S2～S3期外周血单个核细胞中TET3水平高于S1期，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 TET3水平与肝纤维化程度的关系

外周血单个核细胞中TET3水平与肝纤维化病理分期呈正相关关系(rs=0.811，P<0.001)。

图1 TET3与肝纤维化病理分期的散点图

2.4 TET3诊断肝纤维化程度的效能

外周血单个核细胞中TET3诊断≥S2期、≥S3期和S4期的AUC分别为0.873、0.940和0.930，均大于APRI指数和FIB-4指数的AUC，差异均有统计学意义[APRI(Z=2.037，P=0.042；Z=4.560，P<0.001；Z=3.161，P<0.001)，FIB-4(Z=3.124，P=0.002；Z=5.976，P<0.001；Z=4.670，P<0.001)]。见表2、图2。

表2 TET3诊断肝纤维化程度的效能比较

图2 TET3诊断肝纤维化程度的ROC曲线 A 肝纤维化程度≥S2期 B 肝纤维化程度≥S3期 C 肝纤维化程度为S4期

3 讨论

研究表明，下调DJ-1蛋白表达可降低肝细胞、肝脏库普弗细胞氧自由基水平，同时减少中性粒细胞和吞噬细胞浸润，抑制肝纤维化进展[17]。及时了解CHB患者肝纤维化程度并进行干预，对于改善患者预后意义重大。肝脏病理学活组织检查是评价肝纤维化程度的金标准，但由于其为有创性检查，难以动态评估肝纤维化程度；此外，若取样不足，无法进行评估[18]。瞬时弹性成像技术是无创性评估肝纤维化程度的方法之一，具有较高的价值[19]，但对有腹水、肥胖或肋间隙较小的患者，其评估结果的效能较低[20]；此外，该检查费用较高，对于操作技术也有一定要求，因此临床大规模应用受限。

TET3在人肝纤维化组织和小鼠肝纤维化组织中均高表达。TET3/TGF-β1的正反馈回路不仅可促使肝星状细胞表达纤维化相关基因，还可诱使肝细胞大量表达TGF-β1，促进了肝纤维化的进展。有研究表明，抑制TET3表达，可改善四氯化碳诱导的肝纤维化[13]。由此推测，TET3可通过上述机制参与CHB患者肝纤维化的发生及发展过程，检测其在外周血单个核细胞中的表达水平有望评估肝纤维化程度。

本研究比较了S1期、S2～S3期和S4期患者外周血单个核细胞中TET3的表达水平，结果显示S4期外周血单个核细胞中TET3的表达水平高于S1期和S2～S3期，S2～S3期外周血单个核细胞中TET3的表达水平高于S1期，表明随CHB肝纤维化程度加重，外周血单个核细胞中TET3的表达水平也随之升高，提示外周血单个核细胞中TET3的表达水平与肝纤维化关系密切。随后，本研究进一步分析了CHB肝纤维化患者外周血单个核细胞中TET3的表达水平与肝纤维化程度的关系，结果显示外周血单个核细胞中TET3的表达水平与肝纤维化病理分期呈正相关，提示检测CHB肝纤维化患者外周血单个核细胞中TET3的表达水平有助于评估肝纤维化程度。

APRI指数和FIB-4指数的计算较为简便，相关指标的检测费用也较为低廉，已被欧洲肝病指南推荐为评估慢性丙型肝炎肝纤维化的指标，尤其适用于医疗技术不发达的地区[21]。多项研究表明，APRI指数和FIB-4指数对于评估CHB肝纤维化程度具有较高价值[22-23]。本文构建了TET3、APRI指数和FIB-4指数诊断肝纤维化程度≥S2期、≥S3期和S4期的ROC曲线，结果显示外周血单个核细胞中TET3诊断≥S2期、≥S3期和S4期的AUC分别为0.873、0.940和0.930，均大于APRI指数和FIB-4指数的AUC，提示外周血单个核细胞中TET3的表达水平可辅助评估CHB肝纤维化程度。

综上所述，CHB肝纤维化患者外周血单个核细胞中TET3的表达水平与肝纤维化程度关系密切。CHB肝纤维化患者外周血单个核细胞中TET3的表达水平越高，提示肝纤维化程度越严重。检测CHB患者外周血单个核细胞中TET3的表达水平可辅助评估肝纤维化程度，有利于临床动态评估抗纤维化治疗方案的疗效。本研究的不足之处在于为单中心研究，纳入样本均为同一地区患者，为避免对实验结果造成偏倚，今后还需进一步开展多中心、跨地域的深入研究。