miR⁃32⁃5p靶向FOXN3调控EMT通路影响子宫内膜癌细胞迁移和侵袭

董艳 杜安飞 辛本勤 曹佳伟

作者单位：1.日照市妇幼保健院检验科，山东，日照276800

2.日照市莒县中医医院检验科，山东，日照276800

3.日照市中心血站，山东，日照276800

4.青岛市胸科医院检验科，山东，青岛266000

子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）是最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率呈上升趋势［1］。标准治疗包括原发性子宫切除术和双侧输卵管卵巢切除术［1］，为提高复发或转移患者的生存质量，个性化的分子靶向治疗也在进行研究和试验。研究显示胰腺癌中miR⁃32⁃5p 表达上调，并通过下调第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homologue deleted onchro⁃mosome ten，PTEN）表达促进胰腺癌转移［2］。宫颈癌中miR⁃32⁃5p 低表达，miR⁃32⁃5p 通过靶向同源盒B8（homeobox B8，HOXB8）抑制宫颈癌细胞恶性行为［3］。有报道称EC 中miR⁃32⁃5p 高表达［4］，但其在EC 中的作用并未阐明。叉头蛋白N3（Fork head Box N3，FOXN3）是一种转录抑制因子，参与细胞周期调控和肿瘤发生等过程［5］。研究显示FOXN3 在肝癌、肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤中显著下调，上调FOXN3 可抑制癌细胞的上皮⁃间充质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）进程，抑制肿瘤转移，在癌症进展中充当抑癌基因角色［6］。本研究通过Starbase 预测发现，miR⁃32⁃5p与FOXN3可能存在靶向关系。

1 材料与方法

1.1 材料

人正常子宫内膜上皮细胞hEEC 购自北纳生物，EC 细胞JEC 由本院子宫内膜癌患者自愿捐赠，EC 细胞系Ishikawa 和HEC⁃1A 购自美国ATCC；McCoy's 5a 培养基、杜尔伯格伊戈尔培养基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco 公司；引物、miR⁃32⁃5p 模拟物（miR⁃32⁃5p）、miR⁃32⁃5p抑制剂（anti⁃miR⁃32⁃5p）、FOXN3 过表达载体（pcDNA⁃FOXN3）、FOXN3 抑制剂（si⁃FOXN3）和对照（miR⁃con、anti⁃miR⁃con、si⁃con 和pcDNA⁃con）、FOXN3 的野生型（wild type，WT）和突变型（mutant type，MUT）双荧光素酶报告载体购自上海吉玛制药有限公司；FOXN3 抗体、E⁃钙粘蛋白（E⁃Cadherin）抗体、N⁃钙粘蛋白（N⁃Cadherin）抗体和波形蛋白（Vimentin）抗体购自英国Abcam 公司；β⁃actin 抗体购自上海碧云天生物技术有限公司；双荧光素酶报告系统购自美国Promega 公司；Lipofectamine 2000 转染试剂、总RNA 提取试剂盒、real⁃time PCR 试剂盒、反转录试剂盒购自美国Invitrogen 公司；光学显微镜、全自动酶标仪、发光仪和Real⁃time PCR 仪购自美国Bio⁃Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染

在DMEM 高糖培养液中分别培养hEEC、Ishi⁃kawa 和JEC 细胞，在McCoy's 5a 培养液中培养HEC⁃1A 细胞，培养液中均添加10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 链霉素，培养条件：在饱和湿度、37℃5%CO2培养箱中培养细胞，消化传代。以2×l06个细胞/mL 接种Ishikawa 细胞于6 孔板培养，当细胞基本融合为一层时根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染。未转染细胞记为正常对照（NC）组（①组）。根据转染物不同分为anti⁃miR⁃32⁃5p 组（②组）、anti⁃miR⁃con 组（③组）、pcDNA⁃con组（④组）、pcDNA⁃FOXN3 组（⑤组）、miR⁃con 组（⑥组）、miR⁃32⁃5p 组（⑦组）、anti⁃miR⁃32⁃5p+si⁃con组（⑧组）、anti⁃miR⁃32⁃5p+si⁃FOXN3组（⑨组）、miR⁃con+WT⁃FOXN3 组（⑩组）、miR⁃32⁃5p+WT⁃FOXN3组（○1组）、miR⁃con+MUT⁃FOXN3 组（○12组）、miR⁃32⁃5p+MUT⁃FOXN3 组（○13组）。转染48 h，收集细胞，qRT⁃PCR 检测Ishikawa 细胞中miR⁃32⁃5p 或FOXN3 表达水平来验证转染效果，进行后续实验。

1.2.2 qRT⁃PCR 检测RNA 的表达

用Total RNA 提取试剂盒从EC 细胞中提取细胞总RNA，然后反转录合成cDNA，反应程序为30℃10 min，42℃30 min，99℃5 min；4℃5 min。cDNA 并检测，然后以cDNA 为模板，按照real⁃time PCR 试剂盒的说明书进行反应，合成miR⁃32⁃5p 和FOXN3 mRNA，反应程序为：95℃2 min；95℃30 s、60℃40 s、72℃45 s，35 个循环；72℃5 min。运用2⁃ΔΔCt方法进行数据分析。

1.2.3 Transwell 检测细胞迁移和侵袭能力

用无血清DMEM 培养液稀释细胞至浓度2×105个细胞/mL，Transwell 上室加100 μL 细胞悬液，下层加含20% FBS 的培养液。培养箱孵育24 h，用无菌棉签拭去上层小室未迁移细胞，5%甲醛固定迁移细胞，0.1%结晶紫染色，显微镜随机选择5个视野拍照、计数，以平均值表示Ishikawa 细胞侵袭数量。采用Matrigel 基质胶包被的Transwell 装置，其他步骤同迁移实验。

1.2.4 Western blot 实验

RIPA 裂解液室温裂解各组Ishikawa 细胞，BCA试剂盒检测蛋白浓度。以β⁃actin 为内参照，分析蛋白水平。

1.2.5 双荧光素酶报告系统实验

将构建的WT⁃FOXN3 和MUT⁃FOXN3 分别与miR⁃con 或miR⁃32⁃5p 共转染Ishikawa 细胞，转染48 h，裂解细胞，离心收集上清，直接检测荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为内参照，计算相对萤火虫荧光素酶活性。

1.3 统计学处理

用SPSS 19.0 软件进行数据统计分析；计量资料以（）表示，两组间采用独立样本t检验，多组间采用单因素方差分析；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EC 系中miR⁃32⁃5p 和FOXN3 的表达情况

与hEEC 细胞相比，Ishikawa、HEC⁃1A 和JEC组细胞中miR⁃32⁃5p 表达量均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），FOXN3mRNA 和蛋白表达量均显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 EC 细胞系中miR⁃32⁃5p 和FOXN3 的表达情况（±s）Table 1 Expression levels of miR⁃32⁃5p and FOXN3 in EC cell lines（±s）

表1 EC 细胞系中miR⁃32⁃5p 和FOXN3 的表达情况（±s）Table 1 Expression levels of miR⁃32⁃5p and FOXN3 in EC cell lines（±s）

组别hEEC Ishikawa HEC⁃1A JEC F 值P 值n9 9 9 miR⁃32⁃5p 1.00±0.10 2.35±0.24 1.86±0.19 1.75±0.18 82.369 0.000 FOXN3 mRNA 1.00±0.10 0.24±0.03 0.32±0.04 0.38±0.05 290.800 0.000

2.2 miR⁃32⁃5p 低表达对Ishikawa 细胞迁移和侵袭的影响

与anti⁃miR⁃con 组相比，anti⁃miR⁃32⁃5p 组的Ishikawa 细胞中miR⁃32⁃5p 表达量显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；E⁃Cadherin 表达升高，N⁃Cadherin 和Vimentin 表达量均降低（P<0.05），迁移和侵袭细胞数均显著降低（P<0.05）。见表2。

表2 miR⁃32⁃5p 低表达对Ishikawa 细胞迁移和侵袭的影响（±s，n=9）Table 2 Effects of miR⁃32⁃5p low expression on migration and invasion of Ishikawa cells（±s，n=9）

表2 miR⁃32⁃5p 低表达对Ishikawa 细胞迁移和侵袭的影响（±s，n=9）Table 2 Effects of miR⁃32⁃5p low expression on migration and invasion of Ishikawa cells（±s，n=9）

组别①组②组③组F 值P 值miR⁃32⁃5p 1.00±0.11 1.00±0.10 0.38±0.04 145.975 0.000 E⁃Cadherin 0.32±0.03 0.30±0.04 0.75±0.08 196.079 0.000 N⁃Cadherin 1.10±0.12 1.15±0.13 0.45±0.05 121.820 0.000 Vimentin 0.90±0.10 0.92±0.09 0.38±0.04 128.467 0.000细胞迁移数量223.05±22.50 225.46±22.34 102.78±10.38 119.350 0.000细胞侵袭数量150.43±15.27 146.45±13.65 81.16±8.11 84.173 0.000

2.3 FOXN3 高表达对Ishikawa 细胞迁移和侵袭的影响

与pcDNA⁃con 组相比，pcDNA⁃FOXN3 组的Ishikawa 细胞中FOXN3 表达量显著升高（P<0.05），E⁃Cadherin 蛋白表达水平显著升高（P<0.05），N⁃Cadherin 和Vimentin 蛋白表达水平显著降低（P<0.05），细胞迁移和侵袭数量显著降低（P<0.05）。见表3。

表3 FOXN3 高表达对Ishikawa 细胞迁移和侵袭的影响（±s，n=9）Table 3 Effects of FOXN3 overexpression on migration and invasion of Ishikawa cells（±s，n=9）

表3 FOXN3 高表达对Ishikawa 细胞迁移和侵袭的影响（±s，n=9）Table 3 Effects of FOXN3 overexpression on migration and invasion of Ishikawa cells（±s，n=9）

组别①组④组⑤组F 值P 值FOXN3 0.30±0.03 0.35±0.04 0.85±0.09 235.613 0.000 E⁃Cadherin 0.35±0.04 0.36±0.05 0.72±0.07 133.300 0.000 N⁃Cadherin 1.08±0.11 1.05±0.12 0.45±0.06 113.292 0.000 Vimentin 0.88±0.08 0.90±0.09 0.41±0.04 128.963 0.000细胞迁移数量225.01±22.51 224.18±22.52 98.25±9.91 129.195 0.000细胞侵袭数量153.28±15.39 148.07±15.03 72.18±7.50 107.199 0.000

2.4 miR⁃32⁃5p 靶向FOXN3

FOXN3 的3'⁃UTR 与miR⁃32⁃5p 的结合位点，见图1。与miR⁃con+WT⁃FOXN3 组相比，miR⁃32⁃5p+WT⁃FOXN3 组Ishikawa 细胞的荧光素酶相对活性显著降低（P<0.05）；而与miR⁃con+MUT⁃FOXN3 组比较，miR⁃32⁃5p+MUT⁃FOXN3 的荧光素酶相对活性无明显变化。与anti⁃miR⁃con组比较，anti⁃miR⁃32⁃5p 组Ishikawa 细胞中FOXN3表达量显著升高（P<0.05）。见表4、表5。

图1 miR⁃32⁃5p 靶向调控FOXN3 表达Figure 1 miR⁃32⁃5p targets and regulates the expression of FOXN3

表4 双荧光素酶活性检测（±s，n=9）Table 4 Double luciferase activity assay（±s，n=9）

表4 双荧光素酶活性检测（±s，n=9）Table 4 Double luciferase activity assay（±s，n=9）

组别分组⑩○1○12○13 t 值P 值荧光素酶相对活性1.00±0.15 0.33±0.03 13.140 0.000 t 值P 值荧光素酶相对活性1.01±0.12 0.98±0.11 0.553 0.588

表5 Western Blot 检测FOXN3 的表达（±s，n=9）Table 5 The expression level of FOXN3 was detected by Western blot（±s，n=9）

表5 Western Blot 检测FOXN3 的表达（±s，n=9）Table 5 The expression level of FOXN3 was detected by Western blot（±s，n=9）

组别⑥组⑦组②组③组F 值P 值FOXN3 0.32±0.03 0.10±0.01 0.36±0.04 0.75±0.08 292.367 0.000

2.5 敲减FOXN3 逆转miR⁃32⁃5p 低表达对Ishika⁃wa 迁移和侵袭的影响

与miR⁃32⁃5p+si⁃con 组相比，miR⁃32⁃5p+si⁃FOXN3 组的FOXN3 和E⁃cadherin 表达量显著降低（P<0.05），N⁃cadherin 和Vimentin 表达显著上升，迁移和侵袭细胞数均显著上升（P<0.05）。见表6。

表6 敲减FOXN3 逆转miR-32⁃5p 低表达对Ishikawa 迁移和侵袭的影响（±s，n=9）Table 6 Knockdown of FOXN3 reversed the effect of downr⁃expression of miR⁃32⁃5p on migration and invasion of Ishikawa cells（±s，n=9）

表6 敲减FOXN3 逆转miR-32⁃5p 低表达对Ishikawa 迁移和侵袭的影响（±s，n=9）Table 6 Knockdown of FOXN3 reversed the effect of downr⁃expression of miR⁃32⁃5p on migration and invasion of Ishikawa cells（±s，n=9）

组别②组③组⑧组⑨组F 值P 值FOXN3 0.35±0.04 0.76±0.08 0.78±0.09 0.42±0.05 97.339 0.000 E⁃Cadherin 0.30±0.03 0.70±0.10 0.72±0.08 0.38±0.04 89.079 0.000 N⁃Cadherin 1.10±0.13 0.40±0.04 0.42±0.05 1.00±0.10 160.568 0.000 Vimentin 0.90±0.10 0.36±0.04 0.40±0.05 0.80±0.09 122.541 0.000细胞迁移数223.67±22.37 113.46±11.35 110.32±11.04 200.49±20.05 107.308 0.000细胞侵袭数151.37±15.16 80.42±8.05 82.14±8.25 131.09±13.11 85.329 0.000

3 讨论

EC 多发于老年妇女，其发病率和死亡率呈上升趋势，发病年龄较前几年有所下降［7⁃8］。研究EC的分子抑制靶点，对患者的个性化靶向治疗具有重要意义。

miR⁃32⁃5p 在多种癌症中出现差异表达，在癌细胞的凋亡、化学敏感性、转移和耐药性中起着重要作用。前列腺癌中顺铂治疗后miR⁃32⁃5p 表达下调，参与调节前列腺癌化学敏感性［9］。透明细胞肾细胞癌中miR⁃32⁃5p 高表达促进癌细胞侵袭和迁移，舒尼替尼也通过调控miR⁃32⁃5p 发挥抑癌作用［10］。肝癌多药耐药细胞中miR⁃32⁃5p 表达升高，诱导多药耐药［11］。miR⁃32⁃5p 在EC 中表达上调，其具体作用和机制尚不清楚。本研究结果表明，EC细胞系Ishikawa、HEC⁃1A 和JEC 中miR⁃32⁃5p 表达均显著升高，与上述研究结果［7］一致；采用表达差异较大的Ishikawa 细胞进行功能分析，结果表明低表达miR⁃32⁃5p 可抑制Ishikawa 细胞迁移和侵袭。说明miR⁃32⁃5p 在EC 的发展中具有重要作用。

Starbase 预测发现FOXN3 的3'⁃UTR 与miR⁃32⁃5p 存在结合位点，提示两者存在调控关系。FOXN3 编码叉头/翼螺旋转录因子家族的一个成员，可通过与Ski 相互作用蛋白（Ski interacting protein，SKIP）结合参与细胞基本过程调控，在肿瘤发生和对癌症治疗的反应中起重要作用［12］。结直肠癌中FOXN3 显著下调，被证实是N⁃cadherin的直接转录抑制因子，对肿瘤的迁移、侵袭和转移均具有重要作用［13］。FOXN3 在骨肉瘤中下调，上调FOXN3 抑制骨肉瘤迁移和侵袭［14］。FOXN3 在EC中的表达和作用尚不清楚。本研究结果说明FOXN3 在EC 细胞的转移中具有重要作用。此外，miR⁃32⁃5p靶向负调控FOXN3表达，敲减FOXN3部分逆转了抑制miR⁃32⁃5p 表达对Ishikawa 细胞迁移和侵袭的影响，证实了在EC 中两者存在调控关系。

EMT 是肿瘤细胞转移的重要前提，在此过程中上皮细胞极性丧失，形成了一种以细胞骨架重塑和迁移活动为特征的间充质样特性［15］。本研究发现，Ishikawa 细胞中miR⁃32⁃5p 低表达和FOXN3过表达均可抑制间质标志物N⁃cadherin 和Vimentin表达，促进上皮标志物E⁃cadherin 表达，抑制EMT进程，而敲减FOXN3 部分逆转了抑制miR⁃32⁃5p表达对细胞EMT 的影响，这与Chen 等［16］报道FOXN3 在舌鳞癌中的抗EMT 作用吻合。

综上所述，本研究证实，miR⁃32⁃5p 靶向FOXN3 可能通过抑制EMT 通路抑制EC 细胞的迁移和侵袭。miR⁃32⁃5p 可能是EC 的潜在分子靶点。