抗青光眼药物治疗对眼表的损伤表现

许咪 沈韵之 孙松

目前治疗青光眼降低眼压主要通过3种药物途径[1]：(1)扩增房水途径，如毛果芸香碱、前列腺素衍生物；(2)抑制房水生成，如β-肾上腺素受体阻滞剂、碳酸酐酶抑制剂；(3)减少眼内容积，如高渗脱水剂。为了保持药物的药效和长期使用性，药物中不可避免地添加了防腐剂，但是许多研究表明，长时间使用含或不含防腐剂抗青光眼药物的局部治疗可能会诱发不同程度的眼表损伤，如最常用的防腐剂苯扎氯铵(benzalkonium chloride，BAK)，其在70%的抗青光眼药物中的浓度为0.003%至0.02%。BAK是一种季铵盐，可作为去污剂破坏细胞膜，从而破坏微生物，具有毒性作用，通过破坏DNA、紧密连接并诱导细胞凋亡或坏死来破坏角膜上皮细胞结构；导致结膜下纤维化和杯状细胞丢失；还可能影响小梁网等结构，对青光眼滤过手术后期产生负面影响，从而导致或加重眼表疾病[2]。

一、抗青光眼治疗药物对角膜的影响

1.角膜上皮 抗青光眼治疗药物可诱导角膜上皮细胞坏死或凋亡并抑制细胞增殖。Pozarowska等[3]在探讨青光眼局部用药前列腺素类似物、β-肾上腺素受体阻滞剂、碳酸酐酶抑制剂对3种人上皮角膜细胞生长影响中发现，这3类抗青光眼药物均可造成角膜上皮细胞的坏死或凋亡，且在角膜上皮细胞中发挥着细胞抑制和细胞毒性作用。Noecker等[4]对新西兰大白兔兔眼滴用酒石酸溴莫尼定、噻吗洛尔、拉坦前列素等滴眼液，30 d后通过角膜扫描电镜检测发现，这些抗青光眼药物均能对兔眼的角膜上皮造成一定的损伤，其角膜上皮损伤超微结构表现为微绒毛丢失、上皮细胞空洞增多和角膜暗细胞增多等，这些表现均意味着凋亡的角膜上皮细胞增多。Beckwith-Cohen等[5]也对局部滴用了碳酸酐酶抑制剂后的狗眼进行了观察，发现其眼表表现为严重的弥漫性角膜炎，组织病理表现为2个不同部位的炎性浸润，前基质主要浸润为浆细胞，上皮主要浸润为T淋巴细胞和中性粒细胞，免疫组化表现为基质细胞和上皮细胞对IgG的强阳性反应，该研究认为局部使用碳酸酐酶抑制剂也可以引起角膜相关病变。Hashimoto等[6]在研究抗青光眼6种固定组合药物(拉坦前列素/卡特洛尔、拉坦前列素/噻吗洛尔、他氟前列素/替莫洛尔、特拉沃前列素/噻吗洛尔、苯并酰胺/噻吗洛尔和多佐胺/噻吗洛尔)对人角膜上皮的治疗毒性中发现，用药物处理30 min后，人角膜上皮可见受损表现，透射电子显微镜下显示处理后的人角膜上皮中可见多个细胞连接结构或塌陷的细胞连接结构，青光眼固定组合滴眼液对人角膜上皮具有不同的毒性作用，尤其是拉坦前列腺素/噻吗洛尔、苯丙酰胺/噻吗洛尔和多佐胺/噻吗洛尔损伤程度更大。

Uusitalo等[7]观察了拉坦前列腺素转换为不含防腐剂的他氟前列素治疗持续12周的眼表情况，结果发现在使用无防腐剂的他氟前列素治疗期间，角结膜荧光染色异常、睑缘炎、结膜充血和Schirmer检查(泪液分泌试验)异常的患者数量明显降低，泪膜破裂时间提高，表明在降压效果相同的情况下，不含防腐剂的他氟前列素眼表损伤程度更轻。Polyquad是一种聚阳离子防腐剂，常被用于在人工泪液的制备中；SofZia是一种具有氧化特性的防腐剂，与眼表上的阳离子接触后会分解成无毒副产物，Ammar等[8]研究不同含或不含防腐剂的抗青光眼药物对培养的眼角结膜上皮细胞的潜在影响时发现，0.004%曲伏前列腺素(用sofZia保存)和0.004%曲伏前列腺素(用Polyquad保存)比0.004%曲伏前列腺素 (用BAK保存)具有更大的角结膜细胞存活率，说明BAK对培养的眼上皮细胞具有明显的体外细胞毒性。Kabashaima等[9]评估TBE(without preservatives by combining trometamol, boric acid, and ethylenediaminetetraacetic acid，由曲美他莫，硼酸和乙二胺四乙酸结合)引起的角膜损伤，并将其与BAK引起的角膜损伤进行比较，用BAK或TBE处理人角膜上皮细胞系，测量其细胞活力、引起50%细胞死亡(50% cell death，CDT50)的暴露时间、治疗前后测量跨上皮电阻(transepithelial electrical resistance，TEER，反映紧密连接的功能)及通过免疫染色和Western印迹检测Occludin(属于紧密连接蛋白)，结果表明，在BAK组中细胞活力以剂量依赖性方式降低，TEER的恢复以剂量依赖性的方式延迟。TBE组的细胞活力明显高于BAK组。TBE组的CDT50大于BAK组的CDT50，TEER恢复的时间更早，Occludin破坏程度更少。这些研究结果提示BAK通过破坏上皮细胞紧密连接发挥对角膜上皮细胞毒性作用，且其毒性随时间延长和浓度增大而增加，由此可见，选择低BAK水平，不含防腐剂的制剂(例如TBE)或替代性防腐剂(例如sofZia)可能会减少抗青光眼药物的副作用，提高治疗的耐受性。

2.角膜基底下神经 抗青光眼药物治疗可以引起角膜基底下神经密度降低。Martone[10]等对使用了含防腐剂的抗青光眼药物治疗后的角膜神经进行了体内共聚焦显微镜分析，发现所有抗青光眼药物治疗组的基底下神经数量均低于正常组(P<0.05)，神经曲折度明显高于正常组(P<0.05)。Saini等[11]对使用两种或两种以上抗青光眼药物治疗至少6个月的患者的眼表情况进行了前瞻性分析，统计学研究显示角膜结膜染色和眼表疾病指数量表评分(ocular surface disease index，OSDI)与中央角膜基底下神经密度呈显着负相关，而泪膜破裂时间，角膜敏感性与角膜中央基底下神经密度呈正相关。而在对长期抗青光眼药物治疗的慢性青光眼患者进行局部环孢素治疗后，再次评估患者眼表和角膜中央基底下神经的变化情况，发现环孢素治疗后的平均泪膜破裂时间延长(P=0.007)，OSDI 平均得分降低(P=0.007)，角膜感觉评分上升(P=0.002)，角膜中央基底下神经密度增加(P=0.0001)，局部环孢素治疗后患者眼表情况明显改善，且角膜中央基底下神经密度明显增加[12]，这些结果提示长期抗青光眼治疗药物引起的干眼症状可能与基底下神经密度降低有关，且这一损伤是可逆的。

3.角膜内皮 长期抗青光眼药物治疗可以引起角膜内皮细胞密度的减少。Kwon等[13]评估了眼库中经抗青光眼药物治疗后的供体角膜内皮细胞密度的情况，相对于未使用抗青光眼药物治疗的供体，使用抗青光眼药物治疗的供体内皮细胞密度显著降低。樊廷俊等[14]用不同浓度噻吗心安处理体外培养的人角膜内皮细胞 ，观察细胞的生长、增生和形态变化，以及质膜的通透性、 DNA的断片化、细胞的超微结构，结果表明噻吗心安在 0. 15625～ 5 g/L的浓度范围内能显著诱导人角膜内皮细胞凋亡。Wu 等[15]研究了1 / 100、1 / 1,000和1 / 10,000浓度的倍他洛尔、噻吗洛尔、左旋布洛尔、溴莫尼定、卡替洛尔、地匹福林、多佐胺、布林佐胺、拉坦前列素，乌诺前列酮和毛果芸香碱对培养的牛角膜内皮细胞内游离Ca2+迁移率的影响，研究发现溴莫尼定外其余抗青光眼药物均增加了牛角膜内皮细胞内Ca2+浓度，因此猜测抗青光眼药物可能是通过改变Ca2+的迁移率来影响角膜内皮细胞的生理功能的。但是临床上也有研究表明，抗青光眼药物不会导致内皮细胞的丢失，其原因可能是许多相关研究基于细胞和动物实验，且在细胞和动物实验中药物使用浓度远远超过临床上治疗浓度[16]。

4.角膜中央厚度及角膜生物力学特性 Kocabeyoglu等[17]测量原发性开角型青光眼患者一开始使用前列腺素类似物治疗、治疗停止后第6周及重新治疗后第6周的角膜滞后量、角膜阻力因子和角膜中央厚度，结果表明前列腺素类似物治疗停止后第6周角膜滞后量、角膜阻力因子及角膜中央厚度均比一开始使用前列腺素类似物治疗增加(P<0.0001)，但重新使用前列腺素类似物治疗后第6周角膜滞后量、角膜阻力因子及角膜中央厚度均减少，这表明前列腺素类似物治疗可引起原发性开角型青光眼患者角膜滞后量，角膜阻力因子和角膜中央厚度的可逆减少。该研究还发现与对照组相比，接受前列腺素类似物治疗的青光眼患者各基质层的角质细胞密度降低(P<0.001)，说明局部前列腺类似物治疗可以引起原发性开角型青光眼患者角膜细胞密度下降，且与角膜中央厚度呈正相关。然而来自意大利的一项研究，对患有原发性先天性青光眼并接受拉坦前列素治疗至少30个月儿童的中央角膜厚度进行了随时间变化的评估，多变量分析显示角膜中央厚度增加(P=0.03)，这表明在考虑年龄和时间因素情况下，局部拉坦前列素治疗可引起角膜中央厚度增加，且随时间明显增加[18]。

二、抗青光眼治疗药物对结膜的影响

1.结膜上皮 李庆生等[19]利用相干光层析成像术(optical coherence tomography，OCT)对长期使用拉坦前列素滴眼液治疗的55只眼的结膜厚度和结膜上皮厚度进行了前瞻性研究，统计分析表明拉坦前列素治疗后比治疗前结膜厚度显著降低(P<0.001)，但结膜上皮厚度没有发现显着差异，提示长期拉坦前列素治疗能够降低结膜厚度，应考虑其对滤过手术结果的潜在影响。Nenciu等[20]揭示了局部抗青光眼药物治疗后(非选择性β受体阻滞剂、选择性前列腺素类似物、局部碳酸酐酶抑制剂)结膜的结构和免疫组化变化，与对照组(使用不同的防腐剂天然泪液)进行比较，结膜表现为以下变化：鳞状化生(上皮细胞层的厚度和数量显着增加)，炎症(淋巴细胞，巨噬细胞和成纤维细胞数量增加)和结膜下纤维化明显，结构免疫组化证实了慢性炎症的存在，该研究结果表明，BAK是结膜鳞状化生的主要因素。Kamath等[21]研究也发现长期使用抗青光眼治疗药物可以导致结膜上皮鳞状化生程度增加以及炎性细胞的存在。Arici[22]等研究了抗青光眼药物治疗对结膜上皮的凋亡作用，结果显示小梁切除术前接受抗青光眼药物治疗的结膜上皮平均凋亡率明显高于小梁切除术前未接受抗青光眼药物治疗的患者(P=0.0001)，他们认为局部抗青光眼药物对结膜上皮细胞具有凋亡作用，但抗青光眼药物的数量、持续时间和青光眼的类型对细胞凋亡没有明显影响。Dogan[23]在结膜上皮细胞中也观察到凋亡现象，他们认为这可能是由于抗青光眼药物中的防腐剂BAK所致。

2.结膜杯状细胞 Kamath等[21]研究还发现长期使用抗青光眼治疗药物会导致结膜杯状细胞密度降低。Agnifili等[24]利用体内共聚焦显微镜(in vivo confocal microscopy，IVCM)研究前列腺素/噻吗洛尔固定联合治疗的青光眼患者的结膜杯状细胞密度，相比拉坦前列素+噻吗洛尔组合，不含防腐剂的比马前列素/替莫洛尔治疗患者的结膜杯状细胞损伤程度更小(P<0.05)，毒性作用更小，说明BAK会引起杯状细胞密度的降低，从而削弱粘蛋白的产生并影响泪膜的稳定性，造成眼表损伤。

3.免疫炎症反应 有研究者在溴莫尼定治疗的大鼠实验模型中发现结膜组织中IL-1b，IL-2和IL-6的浓度显着低于正常组，CD20+B细胞和CD3+T细胞表达与对照组无明显差异，提示溴莫尼定不会增加结膜的炎性表达[25]。但是Hwang等[26]对208例415只眼使用溴莫尼定治疗至少6个月的青光眼患者进行了回顾性研究，发现19名患者下睑结膜淋巴增生病变，认为溴莫尼定可以作为一种慢性抗原刺激，引起眼部免疫反应，从而导致结膜淋巴增生。Furtado等[27]比较使用前列腺素类似物和其他抗青光眼药物治疗的结膜中HLA-DR(人类白细胞抗原DR等位基因)的表达程度，发现与其他抗青光眼药物相比，局部前列腺素类似物不会增加结膜炎性表达。Taylor 等[28]研究也表明使用前列腺素类似物不会引起结膜炎症，对之后的青光眼滤过手术产生不利影。

三、抗青光眼治疗药物对泪膜的影响

长期应用抗青光眼治疗药物本身及其所含的防腐剂会破坏泪膜的脂质层，使泪膜破裂时间缩短，泪膜稳定性下降，导致患者产生眼部干涩感等不适症状。Lee等[29]使用LipiView眼表干涉仪对30例单眼开角型青光眼患者进行研究，比较抗青光眼药物治疗的眼睛和未经治疗的正常眼睛之间的泪膜脂质层厚度，并评估抗青光眼治疗药物对脂质层厚度参数的影响，结果显示青光眼患者平均脂质层和最小脂质层均比正常组薄(P<0.001)，表明抗青光眼治疗药物可以降低泪膜脂质层厚度。Sedlak等[30]评估前列腺素类似物治疗的患者中泪膜的氧化应激标志物，发现相对于正常对照组，所有研究组中高级氧化蛋白产物含量和总氧化剂状态均较高，BAK保存的拉坦前列素和比马前列素组超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性更高，提示BAK可能会引起氧化应激反应，从而对泪膜造成一定影响。这种发炎机制可能会使干眼处于恶性循环中，影响泪膜渗透压和稳定性，进一步导致眼表上皮损伤、炎性介质释放、杯状细胞丢失和粘蛋白表达障碍，加剧原有的泪膜高渗性和泪膜不稳定性[31，32]。

四、抗青光眼药物治疗对睑板腺的影响

抗青光眼药物可能诱发睑板腺功能障碍，导致泪液大量蒸发，继而引起泪液高渗透压，最终导致干眼症状。Kim等报道了相对于正常组睑板腺障碍患病率的52.5%，50例使用抗青光眼药物治疗超过6个月患者的睑板腺功能障碍患病率为82%，该研究表明，抗青光眼治疗药物可能是影响睑板腺功能障碍的因素之一[33]。Zhang等[34]研究了毛果芸香碱和噻吗洛尔对人睑板腺上皮细胞的形态、存活、增殖和分化的影响，发现4%毛果芸香碱诱导的细胞在3 h时内出现萎缩和脱离、0.4%毛果芸香碱刺激了核周囊泡24 h内的积累增加、0.5%噻吗洛尔诱导的细胞在3 h后出现星形收缩，细胞变圆，附着力变差，而0.05%的剂量并未引起明显的细胞形态变化，实验结果证明，临床上使用的药物会随着浓度的增加对睑板腺上皮细胞造成损伤，影响睑板腺上皮细胞的解剖结构和增殖能力，从而导致睑板腺上皮细胞萎缩，粘附不良或死亡。Sharma等[35]利用IVCM研究前列腺素/噻吗洛尔固定联合治疗的青光眼患者的睑板腺特征，IVCM显示抗青光眼药物治疗患者的睑板腺平均腺泡面积和平均腺泡密度均低，腺孔间隙和腺孔面积均大，拉坦前列素+噻吗洛尔组合更差(P<0.05)。Lee等[36]研究仅接受前列腺素类似物单一疗法的正常眼压性青光眼患者的泪膜与睑板腺参数，研究发现相比正常组，接受前列腺素类似物治疗患者的OSDI评分(P=0.043)，Schirmer试验(P<0.001)，泪膜破裂时间(P<0.001)和所有睑板腺参数(P<0.001)有显着差异，提示前列腺素类似物可能引起睑板腺功能障碍。

五、抗青光眼药物治疗新进展

噻吗洛尔可以造成角膜上皮细胞的坏死或凋亡，而生物可降解口腔溶解片(orally dissolving strips，ODS)不但可以增强噻吗洛尔生物利用度，且在动物体内实验中没有发现其造成角膜的组织病理学改变。生物可降解口腔溶解片可能是一种有前途的滴眼液替代给药系统，可增强噻吗洛尔在原发性开角型青光眼治疗中的递送和治疗活性[37]。R-801是一种氰基胍衍生物，是具有K+-ATP通道开放和抗氧化活性的双功能分子[38]，其作为针对原发性开角型青光眼治疗的新疗法，旨在通过靶向增加小梁网房水流出量从而降低眼压[39]，细胞毒性研究证明了使用该药物后，角膜组织结构上未见明显异常迹象。而新型Rho相关蛋白激酶抑制剂ITRI-E-212也可以通过增加经小梁网流出的房水量，发挥降眼压作用，同时还能够减轻结膜充血[39]。这些药物均被认为是新的，有前途的，安全的，有效的局部抗青光眼药物。