25G经结膜微创玻璃体切除术对眼表功能的影响

汪晓莎 荣蓓 杨柳 张世杰 李骏

经结膜免缝合微创玻璃体切除术(transconjunctival sutureless vitrectomy, TSV)在眼科临床应用近二十年[1]，与传统经睫状体平坦部玻璃体切除术(parsplana vitrectomy,PPV)相比，不需要行环结膜切开，手术创伤减小、术后炎症反应较轻[2，3]，已经成为目前治疗各种玻璃体视网膜疾病的首选手术方式。随着手术的微创化、精细化，其手术适应证也在逐渐扩大[4-8]。虽然手术成功率和患者术后视力逐步提高，但是随着接受手术患者基数的增加和人们对生活质量要求的提高，患者术后出现干眼或干眼加重的问题逐渐显现。

大量研究表明，不同类型眼科手术均会影响眼表功能，造成术后干眼或原有干眼症状加重[9-12]。其中多数手术后的干眼问题已经得到充分重视，针对其术后眼表功能改变、发生机制、治疗和管理措施等问题的研究已经相对充分[13，14]。然而针对TSV术后眼表功能变化的研究却相对较少，尤其缺乏长期的、系统的对患者术后睑板腺功能和结膜杯状细胞密度变化的研究。

本研究旨在观察25G TSV术后患者干眼症状、泪膜稳定性、睑板腺功能和结膜杯状细胞密度的动态变化趋势，并初步探讨造成25G TSV术后患者眼表功能改变的可能原因，以期为临床预防和治疗25G TSV术后干眼问题提供新思路。

资料与方法

一、 研究对象

前瞻性、观察性研究。收集2019年6～9月因各种玻璃体视网膜疾病于北京大学第一医院眼科行25G TSV的患者。

入组标准：年龄≥18岁；男性或非妊娠期女性。

排除标准：持续使用任何眼部局部用药；佩戴角膜接触镜；近6个月内有以下任何眼部病史：眼部感染、眼部过敏及免疫疾病；近6个月内有任何眼部手术史、眼部外伤史；需要做环结膜切开，如行巩膜扣带术、人工晶状体悬吊术等；需要联合其他手术；使用任何与手术无关局部或全身药物的患者需在入组前两周中止用药(洗脱期)。

本研究通过了北京大学第一医院伦理委员会的伦理审核，符合赫尔辛基宣言，受检者均签署了知情同意书。

二、 手术与随访

所有患者的玻璃体切除术均由3位资深玻璃体视网膜专家完成。术前备术眼，冲洗泪道，术前3 d用左氧氟沙星滴眼液，4次/d；术前1 h用复方托吡卡胺滴眼液，共3次，间隔10 min；术前10 min术眼用盐酸奥布卡因滴眼液(倍诺喜)3次，20 g/l利多卡因球后阻滞麻醉。所有患者手术过程顺利，未出现严重并发症。

术后术眼常规给予醋酸泼尼松龙滴眼液(美国Alcon)，第1周4次/d，次数随周次递减，4周停药；左氧氟沙星滴眼液(日本参天)，4次/d，2周后停用；妥布霉素地塞米松眼膏(美国Alcon)，睡前用，持续1周；根据眼部炎症情况决定给药周期，密切观察眼压变化情况。

由同一名住院医师分别于术前1 d、术后1 d、1周、1个月、2个月及3个月分别评估患者双眼以下指标：标准干眼症状评估(standard patient evaluation of eye dryness,SPEED)问卷评分、泪膜破裂时间(tear break up time,TBUT)、睑板腺分泌功能评分(meibomian glandy yielding secretion score,MGYSS)、Marx’s线评分(Marx’s line score,MLS)，并行结膜印迹细胞检查(术后1 d除外)，评估杯状细胞密度和形态变化。

三、观察指标

(一)常规眼科检查

所有患者进行常规眼科检查以明确诊断和排除其他眼部疾病，包括最佳矫正视力(best corrected visual acuity，BCVA)、非接触眼压(Topcon, 日本)、裂隙灯显微镜检查(角膜荧光素染色)、免散瞳彩色眼底照相(CR-2, Topcon, 日本)、谱域相干光层析成像术(spectral domain-optical coherence tomography,SD-OCT) (Haidelber，德国)。

(二)眼表功能检查

1.SPEED问卷评分：用于评价患者干眼症状的严重程度和发作频率的情况，评分为0～ 28分，分数越高说明干眼症状越重。

2.荧光素染色泪膜破裂时间(fluorescein tear breakup time，FTBUT):将无菌生理盐水浸湿的荧光素钠条(1条/袋，中国天津晶明新技术开发有限公司，天津)轻柔接触患者下睑结膜，避免刺激眼部，嘱患者自然眨眼数次后，注视前方不眨眼。裂隙灯钴蓝光下观察并记录患者最后一次眨眼至泪膜出现第一个干燥斑的时间，重复3次，取3次结果平均值记为该眼TBUT值。

3.MGYSS:MGYSS是定量评估睑板腺分泌功能的重要方法。根据Lane方案[15]，使用睑板腺评估器(MGE; Tear Science, Inc., Morrisville, NC)，对患者睑颞、中、鼻三处15个睑板腺口的分泌功能进行评分。各睑板腺口评分标准如下：无分泌物；(1)浓缩的或牙膏状分泌物；(2)混浊的液态分泌物；(3)清亮的液态分泌物。15个睑板腺口分数相加为该眼睑MGYSS值，上、下眼睑的MGYSS值相加记为该眼的MGYSS值，范围0～90分。

4.MLS：Marx’s线位于睑板腺开口(Meibomian orifices ，MOs)结膜面，荧光素钠染色下其位置清晰显现。研究表明，其位置与睑板腺功能相关，越靠近皮肤面，提示睑板腺功能越差。根据MASAHIKO评分方法[16],对患者下眼睑颞、中、鼻3处(每处含3个睑板腺开口)Marx’s 线位置进行评分：0分，Marx’s 线完全位于睑板腺开口结膜面；1分，Marx’s 线部分接触睑板腺开口；2分，Marx’s 线完全穿过睑板腺开口处；3分，Marx’s线完全位于睑板腺开口皮肤面(图1)。

图1 Marx’s线评分标准

5.结膜印迹细胞学检查：患者坐位, 盐酸奥布卡因滴眼液(倍诺喜)局部麻醉结膜囊2 min后, 检查者拇指与食指撑开并固定患者上下眼睑, 以无菌平颞夹住滤纸一角, 粗糙面置于颞侧球结膜(1～2点钟方向，距角膜缘5 mm), 轻压10 s后揭下, 置于95%浓度乙醇中固定2 h, 行PAS染色。光学显微镜下(×40)观察杯状细胞及上皮细胞形态和数量特点，根据Nelson分级[17]标准进行分级。

6.Nelson分级标准：0级，正常,上皮细胞小而圆,易分辨,细胞间紧密结合,胞质嗜曙红,核大,核浆比例为1：1～1：2,杯状细胞>500/mm2,杯状细胞大而圆,PAS重染；1级，轻度鳞状上皮化生,上皮较大, 多形,易分辨,细胞间距离较0级大,细胞大,核小,核浆比1：3,杯状细胞数量下降 (350～500/mm2) ,但仍圆而丰满, PAS染色阳性持续。2级，中度鳞状化生,上皮细胞大,多形,分辨差,细胞间距大,细胞质多形性,细胞核可呈多核状,核小,核浆比1∶4～1∶5,无角质化,杯状细胞严重减少100～350/mm2,形态小,周边不清,PAS染色差。3级，重度鳞状化生,上皮大而多形,孤立,胞质偏蓝,核小,固缩并有较多的无核细胞,核浆比>1∶6,杯状细胞数量下降甚至消失。见图2。

图2 光学显微镜下结膜印迹细胞PAS染色后的Nelson分级(PAS, 10×40)(a)Nelson分级0级(b) Nelson分级1级(c)Nelson分级4级(d)Nelson分级3级(Gautam T, 2015)

四 统计学分析方法

结 果

一、受检者基本特征

本研究共纳入研究对象共36例， 其中2例因个人原因无法进行随访中途退出研究，4例因随访期间需要进行二次眼科手术退出研究，最终完成随访30例。年龄在23～81岁，平均年龄(60±12.1)岁；其中男性12例，女性18例,诊断黄斑前膜8例。原发性或继发性视网膜脱离12例,各种原因导致的玻璃体积血10例(增生期糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜裂孔)；合并糖尿病7例，不合并糖尿病23例。

二、眼表功能指标

1.SPEED问卷评分: 术后1 d、1周、1个月均大于术前1 d,差异具有统计学意义(P<0.05)；术后2个月、3个月与术前1 d比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.TBUT：术后1 d、1周、1个月均低于术前1 d,差异具有统计学意义(P<0.05)；术后2个月、3个月与术前1 d比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

3.MGYSS：术后1 d、1周、1个月均低于术前1 d,差异具有统计学意义(P<0.05)；术后2个月、3个月与术前1 d比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

4. MLS：术后各时间点与术前1 d比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

5.结膜印迹细胞学Nelson分级：术后1周、1个月、2个月均高于术前1 d，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 30例行25G TSV患者术眼手术前后不同时间点SPEED问卷评分、TBUT、结膜印迹细胞学、MGYSS、MLS结果

讨 论

本研究对25G TSV前后患者干眼症状(SPEED问卷评分)、泪膜稳定性(FTBUT)、睑板腺功能(MGYSS)和结膜杯状细胞密度(Nelson分级)进行了评估，旨在客观评估25G TSV术后眼表功能改变及随时间变化的趋势，并初步探讨25G TSV术后患者干眼症状发生发展的原因，以期为临床上25G TSV术后干眼问题的预防和治疗提供新思路。

一、SPEED问卷评分和FTBUT变化趋势分析

SPEED问卷是评价干眼患者主观症状发生频率及严重程度的重要手段，本研究结果显示术后1个月内各时间点的评分结果较术前明显升高，差异具有统计学意义，其中以术后1 d最高，而术后2个月时较术前略降低，差异不具有统计学意义，术后3个月时较术前略升高，差异不具有统计学意义，提示25G TSV会导致患者术后短期内干眼症状加重，而在术后2个月内恢复至术前水平。该结论与Tamer Wasfy等[18]和De等[19]的研究结果一致，即术后1 d及1周干眼症状最显著。但是De等[19]仅评估患者术前及术后1周的干眼症状改变，未对更长时间的症状改变趋势进行评估和描述。本研究延长观察时间至术后3个月，结果显示25G TSV术后2个月以内干眼症状基本恢复至术前水平。

FTBUT是评价泪膜稳定性的客观临床指标，本研究采用FTBUT评估25G TSV前后患者泪膜稳定性的的变化趋势，结果显示术后1个月内的FTBUT较术前明显降低，差异具有统计学意义，其中以术后1 d最低，而术后2个月、3个月时较术前略降低，差异不具有统计学意义，提示25G TSV会导致患者短期内泪膜稳定性降低，而在术后2个月内恢复至术前水平。Sato等[20]研究显示25G TSV术后1个月内患者FTBUT较术前明显降低，该结果与本研究一致。但是该研究只随访至术后1个月，未对1个月后泪膜稳定性改变进行进一步评估。本研究延长随访时间至术后3个月，结果显示FTBUT在术后2个月时恢复至术前水平。

泪液中脂质和黏蛋白成分的改变均可以影响泪膜稳定性。为了探讨25G TSV术后干眼形成的可能原因，本研究应用MGYSS和结膜印迹细胞学方法定量评估了睑板腺功能和结膜杯状细胞密度。

二、MGYSS和MLS变化趋势分析

MGYSS是定量评估睑板腺分泌功能的有效方法。睑板腺功能不良导致泪膜稳定性降低，是蒸发过强型干眼的主要原因。本研究显示，术后1个月内的MGYSS较术前明显降低，差异具有统计学意义，提示25G TSV会导致患者短期内睑板腺分泌功能下降。而观察至术后2个月、3个月时，发现结果较术前略降低，差异不具有统计学意义，反映该变化在术后2个月内基本恢复至术前水平。目前对玻璃体切除术后睑板腺分泌功能变化的研究很少。然而，已经有大量研究表明其他内眼手术，如白内障超声乳化手术、屈光手术等会导致睑板腺分泌功能下降[21-23]。而与常规白内障超声乳化手术相比，25G TSV围术期情况更加复杂多变，患者术后眼部炎症反应可能较白内障手术严重，常需要使用更多种类和剂量的局部药物及更长恢复时间；同时25G TSV本身平均手术时间较常规超声乳化白内障手术更长，开睑器对睑板腺的作用时间更长。因此，结合本研究的结果与白内障超声乳化手术导致睑板腺功能降低的机制进一步明确了25G TSV对睑板腺功能的影响。

Marx’s 线是指位于睑结膜及皮肤交界处后方经荧光素钠等染色剂染色后可显现出来的连续的线型结构，会随着年龄增加逐渐出现变宽和前移趋势，且其前移总是以侵犯睑板腺开口为首要表现[16，24]。因此，近年来Marx’s 线和睑板腺功能之间的关系受到广泛关注。本研究显示，25G TSV虽然会造成短期内睑板腺分泌功能下降，但是对Marx’s 线位置并没有明显影响。而出现MGYSS和MLS变化趋势不一致的结果并不是不合理的。关于Marx’s线的形成机制有不同假说，包括机械损伤等，近年来Bron[24]等提出溶质梯度理论，认为瞬目间泪新月水分蒸发会产生溶质梯度，而其顶点处泪液渗透压最大，长期的高渗状态使该处形成Marx’s线。虽然既往研究表明[24]，玻璃体切除术后1个月内泪新月高度增加，尤其1周时增加显著，但是Marx’s线位置的变化涉及长期刺激下的细胞移行过程，发展时间较长，这解释了本研究中Mmarx’s线评分无明显改变的可能原因。

三、结膜印迹细胞学Nelson分级变化趋势分析

分泌泪液中黏蛋白成分的结膜杯状细胞的数量和形态，是干眼相关研究的热点。本研究显示，术后2个月内的结膜印迹细胞Nelson分级较术前明显升高，差异具有统计学意义，术后3个月时较术前略升高，差异不具有统计学意义，提示25G TSV会导致患者短期内结膜杯状细胞密度减少及结膜上皮细胞鳞状化生，该变化在术后3个月内基本恢复至术前水平。该结果与Heimann等[25]对PPV术后患者的结膜标本进行HE染色和免疫组化染色发现术后结膜上皮层增厚，杯状细胞减少的结果一致。Heimann等[25]具体描述了PPV造成的结膜细胞形态异常的四种表现，首先是术后结膜上皮层增厚，表达黏蛋白MUC5A的杯状细胞数量减少；其次，PPV术后黏蛋白MUC1的表达局限在外层结膜上皮，而正常情况下MUC1在结膜上皮全层都有表达；第三，细胞表面的硫酸类肝素蛋白多糖syndecan-1起到调节结膜细胞间、细胞与细胞外基质间的连接的作用。正常情况下，其存在于结膜上皮全层，并从结膜内层到外层数量逐渐减少，而PPV术后这种阶梯性消失，表现为syndecan-1在全层中重度表达；第四，蛋白多糖TN-C与细胞间连接和伤口愈合相关。正常情况下在结膜上皮组织中轻度表达，PPV术后结膜上皮内TN-C表达水平升高。上述结膜组织的异常，尤其是表达MUC5A黏蛋白的杯状细胞数量减少和表达MUC1黏蛋白的上皮细胞的分布异常可能导致术后干眼的发生。由于该研究为横断面研究，不能观察PPV术后结膜形态的动态变化趋势。本研究通过结膜印迹细胞学方法对25G TSV术后结膜上皮细胞和杯状细胞的改变进行了3个月的连续性动态评估，发现杯状细胞密度变化在术后3个月可基本恢复术前水平。

总之，本研究结果提示25G TSV术后短期内患者眼表功能显著降低。患者出现的干眼症状、泪膜稳定性、睑板腺分泌功能结果均较术前差，但在术后2个月内恢复至术前水平。结膜印迹细胞Nelson分级在术后的改变持续至术后3个月，3个月内恢复术前水平。而术后MLS未见明显改变。睑板腺分泌功能降低和杯状细胞数量减少将直接影响泪膜中的脂质和黏蛋白成分，从而造成术后泪膜稳定性降低，是诱发术后干眼或症状加重的重要原因。尽管25G TSV已经较传统的PPV有很大改进，但仍不可避免地会对眼表组织有一定损害。分析25G TSV后眼表功能降低的原因可能与手术过程中眼表长期暴露、术中操作产生的结膜角膜机械性损伤、开睑器作用、术后炎症反应、围术期局部用药以及聚维酮碘消毒液冲洗结膜囊产生细胞毒性等多种因素相关。

小样本量是本研究的主要局限性，可能导致抽样误差增大，从而影响结论的代表性。其次，纳入的研究对象年龄跨度较大，且平均年龄较大，而年龄是影响干眼发病的原因之一，因此年龄因素可能会给研究结果带来偏倚。另外，纳入研究对象中包含了一部分糖尿病患者，糖尿病同样是影响眼表功能的重要因素之一，可能会带来偏倚。除此之外，考虑到影响术后眼表功能变化的因素的复杂性和样本量的局限性，本研究暂时未对各因素进行进一步多元线性回归分析和病因模型探索。因此，25G TSV 对眼表功能的影响，还需要更多的、设计严谨的研究予以进一步验证。