超声介导FGF21纳泡保护糖尿病小鼠心功能的研究

高嘉梦 孟哲颖 李雁鸣 赫 兰 胡 兵 申 锷

糖尿病患者无症状左心室功能不全和心力衰竭发生率很高，因心力衰竭的住院率和病死率逐步增加[1]。心血管疾病是糖尿病患者死亡的主要原因[2]。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)21是一种治疗代谢综合征的药物。在肥胖和2型糖尿病的临床前模型中，使用FGF21治疗可以改善血糖稳态并促进体重减轻[3]。同时，在1型糖尿病模型中，FGF21通过显著抑制糖尿病小鼠的心脏凋亡，预防心脏重构和心脏功能紊乱[4]。本研究利用超声介导FGF21纳泡对糖尿病小鼠进行预防性治疗，观察其对小鼠心脏结构和功能的影响。

材料与方法

1.主要试剂与仪器：端羧基聚乳酸乙醇酸共聚物(济南岱罡生物工程有限公司)，聚醚酰亚胺(上海阿拉丁公司)，聚乙烯醇(美国Sigma公司)，八氟丙烷(上海众巍化学有限公司)，FGF21蛋白(北京义翘神州公司)，链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)，纳米粒度Zeta电位仪(美国Omni公司)，高分辨场发射扫描电子显微镜(美国FEI公司)，多模式小动物超声(美国Fujifilm公司)，血糖测试仪(德国罗氏公司)。

2.FGF21纳泡制备及其质量评价：采用双乳化法制备FGF21纳泡。具体过程如下：聚乳酸乙醇酸共聚物溶于二氯甲烷作为油相，加入双蒸水作为水相，经过声振形成初次乳化液；向初次乳化液中加入溶解于聚乙烯醇的聚醚酰亚胺，经过声振形成二次乳化液。使用旋转蒸发仪挥发有机溶剂，洗涤3次后获得纳泡；加入FGF21溶液于摇床孵育，离心洗涤获得FGF21纳泡溶液，经冷冻干燥得FGF21纳泡冻干粉，加压注入八氟丙烷气体和0.9%氯化钠注射液充分振荡即可使用。

取少量稀释的FGF21纳泡滴在载玻片上，于显微镜观察；滴在硅片上，风干、喷金，于扫描电镜观察。同时用纳米粒度Zeta电位仪分别测定载药及空白纳米其粒径和Zeta电位。

3.动物模型建立及实验分组：SPF级雄性C57BL/6J小鼠，6周龄，体质量18～20g，购自上海杰思捷实验动物有限公司。48只小鼠适应性饲养达8周龄后，随机选择40只小鼠经腹腔一次性注射STZ(150mg/kg)建立DM模型，其余作为对照组。DM小鼠随机分为4组，即DM组、FGF21组、FGF21纳泡组和FGF21纳泡+超声组，每组10只。72h后随机尾静脉取血测定血糖，血糖≥16.7mmol/L且伴有多饮、多食及多尿现象即建模成功。

4.治疗方法：各组小鼠经6%水合氯醛腹腔注射麻醉后，心前区备皮，对照组及DM组经尾静脉注射0.9%氯化钠注射液，FGF21组和FGF21纳泡组小鼠分别经尾静脉注射相应剂量FGF21和FGF21纳泡。FGF21纳泡+超声组小鼠经尾静脉注射FGF21纳泡，同时在心前区放置超声探头进行定点靶破。其中超声参数设置为频率500kHz，声压2W/cm2，时间5min；在建模成功后开始治疗，每次FGF21给药剂量达100μg/kg，各组小鼠持续给药8周，1周2次。

5.超声心动图检查：实验到达终点时，小鼠诱导麻醉。于胸骨旁左心室长轴M型超声测量分析小鼠左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。

6.HE染色：将取小鼠左心室壁心肌组织于固定、脱水透明、包埋、切片备用。取切片脱蜡、脱水，依次苏木精、伊红染色后封片，于显微镜下观察心肌细胞。

7.天狼星红染色：取石蜡切片脱蜡、脱水，天狼星红染色封片。于显微镜下观察，胶原纤维呈红色。随机选取3个400倍视野，计算心肌胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)。

结 果

1.FGF21纳泡的质量评价：光学显微镜和扫描电镜观察FGF21纳泡呈大小均一、分布均匀的圆球形结构。纳米粒度Zeta电位仪测量空白和载药纳泡的粒径分别为877.5±23.6nm和933.2±27.4nm，粒径的多分散性指数分别为0.106和0.168，均<0.2，表明本研究制备的空白及载药纳泡分散性好。Zeta电位结果显示，空白和载药纳泡的Zeta电位分别为17.44±1.81mV和2.73±1.93mV，表明FGF21蛋白成功负载纳泡表面，详见图1～图4。

图1 光学显微镜下FGF21纳泡(×40)

图2 透射电镜下FGF21纳泡(×25000)

图3 空白纳泡与FGF21纳泡粒径分布

图4 空白纳泡与FGF21纳泡Zeta电位

2.超声心动图评价小鼠心脏功能结果：糖尿病模型建立8周后，与对照组比较，DM组小鼠LVEF、LVFS显著降低(P<0.05)；药物干预性治疗8周后，与DM组比较，FGF21组、FGF21纳泡+超声组小鼠LVEF、LVFS显著升高(P<0.05)；与FGF21组比较，FGF21纳泡+超声组显著升高(P<0.05)；而FGF21纳泡组与DM组小鼠心脏功能指标比较，差异无统计学意义，详见表1。

表1 各组小鼠超声心动图指标测量结果

3.各组小鼠心肌组织HE染色结果：对照组小鼠心肌细胞排列规则，细胞核大小均一；与对照组比较，DM组小鼠心肌细胞明显肥大，心肌细胞排列紊乱，细胞核增大；与DM组比较，FGF21组、FGF21纳泡+超声组小鼠心肌细胞肥大程度降低,其中FGF21纳泡+超声组心肌细胞肥大程度降低最显著，心肌排列较规则；而FGF21纳泡组心肌细胞肥大降低程度与DM组比较，差异无统计学意义，详见图5。

图5 各组小鼠心脏组织HE染色结果(×40)A.对照组；B.DM组；C.FGF21组；D.FGF21纳泡组；E.FGF21纳泡+超声组

4.各组小鼠心肌组织天狼星染色结果：天狼星红染色结果显示心肌胶原纤维呈红色。与对照组比较，DM组小鼠心肌CVF显著升高(9.67%±1.11% vs 1.07%±0.16%，P<0.05)；与DM组比较，经过FGF21和超声介导FGF21纳泡干预后，各组小鼠心肌CVF下降(9.67%±1.11% vs 5.04%±0.28%、3.35%±0.36%，P<0.05)；与FGF21组比较，FGF21纳泡+超声组心肌CVF显著下降(P<0.05)。FGF21纳泡组(8.10%±0.48%)与DM组比较，差异无统计学意义，详见图6。

图6 各组小鼠心脏组织天狼星染色结果(×40)A.对照组；B.DM组；C.FGF21组；D.FGF21纳泡组；E.FGF21纳泡+超声组

结 果

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的主要心脏并发症，其发生不依赖于冠状动脉病变、高血压或其他心脏疾病，具有高发生率和高风险特征[5]。DCM最初表现为舒张功能障碍，随后发展为以各种代谢和神经体液途径紊乱为特征的收缩功能障碍[6]。1型糖尿病相关的DCM，其特征是心肌细胞肥大、心肌胶原沉积和左心室重构，导致左心室舒张末期容量增加，心脏收缩功能受损[7]。临床发现传统的治疗方法，如降糖药、改善心功能等，不能从根本上改善临床症状或治愈DCM。

FGF21在调节各种基本生理代谢过程中发挥关键作用，如降低血糖水平，降低肝脏和血清中甘油三酯水平[8]。越来越多的证据表明外源性FGF21对心血管疾病有保护作用。FGF21通过减轻氧化应激、减少心肌细胞炎症、促进脂肪酸氧化、抑制心肌细胞凋亡等从而改善心肌能量供应和减轻病理性心肌重构，预防甚至逆转糖尿病心肌病[9]。然而，外源性FGF21作为生物大分子具有一定的缺陷，如在体内易降解、生物利用度低等，并且具有多器官效应，限制其对心脏保护作用。

微泡/纳泡作为药物递送的载体，可以保护血液中药物不被降解，延长循环血药浓度、增加药物的生物利用度。微泡/纳泡递送药物的形式多种多样，药物可以通过共价键或非共价键结合在微泡表面，可以被包覆在核心，也可以通过脂质体、聚合物等结合后附着在微泡/纳泡表面[10]。超声由于可以通过细胞膜控制治疗药物的递送，已经成为一种具有前景的治疗手段。当含气微泡/纳泡暴露在超声波下时，发生膨胀与收缩，导致周围的液体快速流动，对周围组织产生机械作用，导致可逆性的细胞膜通透性升高，从而促进药物释放和通过细胞膜外渗[11]。

本研究根据前期实验的双乳化法，通过非共价结合方式合成载FGF21纳泡[12]。已有研究证实，聚乳酸乙醇酸共聚物因具有良好的生物相容性和优良的药代动力学特性等优点而成为广泛应用的成膜材料，聚醚酰亚胺修饰的聚乳酸乙醇酸共聚物纳米颗粒具有正电荷，与DNA/蛋白质静电结合，比制备阳离子脂质体更稳定、更易操作[13]。通过对载药的纳泡的质量考察证实，本研究制备的载FGF21纳泡大小均一，分散性、稳定性好。通过反复加压注入八氟丙烷气体后，实现体内超声成像和超声靶向治疗作用[14]。整个制备过程在低温中完成，保证蛋白药物的生物活性。在小鼠尾静脉给药同时，于心脏局部施加低频超声，实现载FGF21纳泡在心肌组织中的定点靶向释药。

为了证实载FGF21纳泡结合超声靶向治疗的有效性，本研究通过心脏超声检查，评估超声结合FGF21纳泡对糖尿病小鼠心脏的保护作用。实验发现，药物干预性治疗8周后，与DM组比较，FGF21组、FGF21纳泡+超声组小鼠LVEF、LVFS显著升高，与FGF21组比较，FGF21纳泡+超声组左心收缩功能改善更加显著升高，而FGF21纳泡组与DM组小鼠心脏功能指标比较，差异无统计学意义。心肌肥大、心肌纤维化是心功能减低的重要原因。同时，心肌病理组织观察结果也证实如此，低频超声介导的FGF21纳泡可显著抑制糖尿病诱导的心肌组织损害和心脏重构。分析其原因可能为FGF21纳泡在通过心脏血管时，在超声波声能下产生空化效应，促使FGF21蛋白的释放，同时在机械力作用下，血管内皮细胞间隙增宽和心肌细胞膜形成可逆性孔道，使得更多的FGF21进入心肌细胞发挥作用发挥生物效应[15]。而FGF21纳泡组，由于缺乏超声作用以及纳泡的保护，释放入血循环发挥生物效应的蛋白量更少，因此其对心脏的保护作用较弱。

综上所述，本研究证实糖尿病小鼠心肌组织发生明显的纤维化，心室顺应性减弱，由此出现心功能下降现象。FGF21由于具有预防病理性心肌重构，FGF21纳泡与低频超声的结合应用，对糖尿病诱导的心脏功能不全发挥积极预防保护作用，有望成为治疗糖尿病心肌病的一种新的手段。