生蒲黄标准汤剂质量评价

谢冉，郝单丽，易红，臧琛，陈燕军，赵庆贺 中国中医科学院中药研究所，北京 100700

蒲黄为香蒲科植物水烛香蒲Typha angustifoliaL.、东方香蒲Typha orientalisPresl或同属植物的干燥花粉[1]。蒲黄的炮制方法有蒸、焙、纸包炒、炒黄、炒炭等，2015年版《中华人民共和国药典》（一部）收载蒲黄饮片为生蒲黄和蒲黄炭，用于各类瘀血证和出 血证。研究表明，蒲黄具有降血脂、调节糖代谢、改善心脑血管功能、抗炎等作用[2-3]，有效成分主要有黄酮类化合物、鞣质、有机酸、多糖类、烷烃类等[4]。其中，黄酮苷类成分香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量最高[5-6]，为蒲黄质量控制的指标成分。

国家药典委员会《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》（以下简称《技术要求》）明确提出了“标准汤剂”概念。中药饮片标准汤剂是以中医理论为指导、临床应用为基础，参考现代提取方法，经标准化工艺制备而成的单味中药饮片水煎剂，用于标准化临床用药，保障用药的准确性和剂量的一致性。中药饮片标准汤剂是在传统中药的大生产过程中，为保证临床疗效不降低、毒性不增加而设计的一个中间过渡对照物[7-9]。

本研究收集12批蒲黄样品，按照《技术要求》和《中药饮片标准汤剂研究策略》[7]推荐方法制备标准汤剂，测定饮片和标准汤剂中香蒲新苷和异鼠李素- 3-O-新橙皮苷的含量，标定主要工艺参数，建立标准汤剂指纹图谱，并进行聚类分析和主成分分析，建立生蒲黄标准汤剂的质量评价方法，为蒲黄相关中药制剂的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪（HP真空脱气泵，HP四元泵，HP自动进样，HP柱温箱，HPLC-DAD检测器），安捷伦科技有限公司；Mettler Toledo-XS105型电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多仪器（中国）有限公司；KQ5200DE型超声波清洗器（功率200 W，频率40 kHz），昆山市超声仪器有限公司；JA2003型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；TG16- WS型台式高速离心机，湖南湘仪；FE20型实验室pH计，Mettler-Toledo公司。

香蒲新苷（含量以97.0%计，批号111573-201405）、异鼠李素-3-O-新橙皮苷（含量以93.2%计，批号112571-201205），中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯（Fisher），其他试剂为分析纯。12批蒲黄样品，采自河北、江苏、内蒙古、山东，经中国中医科学院中药研究所何希荣鉴定，为香蒲科植物水烛香蒲Typha angustifoliaL.、东方香蒲Typha orientalisPresl或同属植物的干燥花粉，样品来源信息见表1。

表1 蒲黄样品来源信息

2 方法与结果

2.1 指标成分含量测定

2.1.1 色谱条件

采用Welch XB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液（15∶85），柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长254 nm。色谱图见图1。理论塔板数按香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷峰计算应不低于5 000。

图1 生蒲黄饮片和标准汤剂2种指标成分HPLC图

2.1.2 溶液制备

2.1.2.1 饮片供试品溶液

取生蒲黄饮片粉末（过4号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 µm滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.2.2 标准汤剂供试品溶液

称取生蒲黄饮片100g，置于2 000 mL圆底烧瓶中，加1 200 mL水，充分润湿，放置浸泡30 min，加热煮沸后回流提取30 min，趁热过滤，滤渣加1 000 mL水，回流提取20 min，趁热过滤，合并2次滤液，60 ℃水浴浓缩至500 mL，即得0.2 g/mL生蒲黄标准汤剂。精密吸取生蒲黄标准汤剂1 mL，超声处理5 min，12 000 r/min离心5 min，0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.2.3 对照品溶液制备

分别取经五氧化二磷减压干燥36 h的香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成香蒲新苷0.94 mg/mL、异鼠李素-3-O-新橙皮苷1.0 mg/mL的溶液。取以上2种对照品溶液，混合，即得混合对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

2.1.3.1 线性关系考察

分别精密吸取香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷对照品溶液1.0 mL，置100、50、25、10、5、2 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度。按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，分别以香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量（μg）为横坐标，制作标准曲线，计算回归方程。香蒲新苷回归方程Y＝444.42X－102.56，R2＝0.998 1，线性范围为0.377 2～18.86 μg；异鼠李素-3-O-新橙皮苷回归方程Y＝618.02X－182.41，R2＝0.998 7，线性范围为0.403 6～20.18 μg。

2.1.3.2 精密度试验

取同一批生蒲黄标准汤剂供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，连续6次，测定并计算香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面积RSD分别为0.22%和0.29%，表明仪器精密度良好。

2.1.3.3 稳定性试验

精密量取生蒲黄标准汤剂供试品溶液适量，按“2.1.1”项下色谱条件，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样，测定并计算香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面积RSD分别为0.46%和0.94%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.3.4 重复性试验

精密量取生蒲黄标准汤剂适量，平行制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，测定并计算香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面积RSD分别为0.25%和1.27%，表明本方法重复性良好。

2.1.3.5 加样回收率试验

精密称取同一批已知含量的供试品，分别精密加入等量香蒲新苷对照品，制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定，结果香蒲新苷平均回收率为100.04%，RSD＝3.05%。同法向供试品中加入异鼠李素-3-O-新橙皮苷对照品，测定并计算异鼠李素-3-O-新橙皮苷平均回收率为102.8%，RSD＝2.12%。表明本法准确度良好。

2.1.4 样品测定

2.1.4.1 指标成分含量及转移率测定

分别精密吸取对照品溶液20 µL、饮片供试品溶液20 µL、标准汤剂供试品溶液10 µL，注入高效液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件测定香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量，计算指标成分转移率。转移率（%）＝W/M×100%。式中，W为标准汤剂中的含量（mg），M为饮片中的含量（mg）。

2.1.4.2 pH值及出膏率测定

取标准汤剂，用pH计测定pH值。

精密吸取混合均匀的标准汤剂10 mL于已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105 ℃烘干3 h，取出，置干燥器中冷却30 min，称定质量，计算出膏率。出膏率（%）＝（w×V）/（v×M）×100%。式中，M为样品量（g），V为标准汤剂体积（mL），v为取样体积（mL），w为取样所得干膏量（g）。

2.1.4.3 样品测定结果

12批生蒲黄标准汤剂的平均出膏率为11.79%±1.29%，香蒲新苷的平均转移率为79.41%±13.9%，异鼠李素-3-O-新橙皮苷的平均转移率为58.66%±18.8%，pH值为5.4～6.4，见表2。结果表明生蒲黄标准汤剂质量均一。所有批次样品中香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷质量分数之和均大于0.5%，符合2015年版《中华人民共和国药典》规定。

表2 生蒲黄标准汤剂主要指标测定结果

2.2 标准汤剂指纹图谱

2.2.1 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、0.05%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～10 min，5%～10%A；10～15 min，10%～15%A；15～35 min，15%A；35～45 min，15%～31.5%A），柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长254 nm。理论塔板数按香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷计算应不低于5 000。

2.2.2 对照品溶液制备

取香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷50μg的混合溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液制备

同“2.1.2.2”项下。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 精密度考察

取同一批供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，连续6次，测定并计算4号峰峰面积，结果RSD＝0.15%，表明仪器精密度良好。

2.2.4.2 稳定性试验

精密量取标准汤剂适量，制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样测定，计算4号峰峰面积，结果RSD＝0.42%，表明24 h内供试品溶液稳定性良好。

2.2.4.3 重复性试验

精密量取生蒲黄标准汤剂适量，平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，测定并计算4号峰峰面积，结果RSD＝0.45%，表明本方法重复性良好。

2.2.5 指纹图谱建立

按“2.2.1”项下色谱条件，分别精密吸取12批生蒲黄标准汤剂供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱峰信息。使用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）对色谱图进行分析，以PH-01为参照图谱，采用平均数法生成对照图谱，时间宽度为0.10 min。标准汤剂及对照图谱见图2、图3。共有峰共7个，通过对照品比对指认2个峰，分别为4号峰香蒲新苷和5号峰异鼠李素-3-O-新橙皮苷。

图2 12批生蒲黄标准汤剂指纹图谱

图3 生蒲黄标准汤剂指纹图谱共有峰

2.2.6 相对保留时间及相对峰面积测定

对照图谱中，7号峰面积最大，且保留时间稳定，故选择7号峰为参照峰，保留时间及峰面积设为1.00，计算各峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表3。

表3 生蒲黄标准汤剂指纹图谱各共有峰相对保留时间和相对峰面积

2.2.7 相似度评价

采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）进行相似度分析，12批标准汤剂指纹图谱相似度见表4。结果表明，除PH-09外，其他11批标准汤剂具有较好的一致性。

表4 12批生蒲黄标准汤剂指纹图谱相似度

2.2.8 聚类分析

香蒲新苷（4号峰）和异鼠李素-3-O-新橙皮苷（5号峰）为蒲黄的主要有效成分，而且分离良好，为所有样品共有，故选择4号峰和5号峰为变量，通过SPSS25.0软件对12批样品进行聚类分析，采用Ward联接法，以平方欧氏距离为样本测度，12批生蒲黄标准汤剂可分为3类，见图4。PH-02、PH-04、PH-06、PH-08、PH-11、PH-12为第一类，PH-01和PH-09为第二类，PH-03、PH-05、PH-07、PH-10为第三类。

图4 12批生蒲黄标准汤剂聚类分析树状图

2.2.9 主成分分析

将12批标准汤剂色谱图中7个共有峰的峰面积导入SPSS25.0软件进行主成分分析。通过降维中的因子分析，进行KMO和巴特利特检验，KMO取样适切性量数为0.571，KMO＞0.5且P＜0.05，表明该数据适合做因子分析。提取3个主成分因子，计算得分值、累计方差贡献率、旋转后的成分矩阵和相关系数矩阵，结果见表5～表7。主成分1、2、3的累计方差贡献率达95.983%，表明这3个主成分能够代表样本的整体质量。成分矩阵显示，4号峰和5号峰对主成分1的影响最大，表明香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷在蒲黄的质量控制中具有重要作用。根据主成分分析得分图可将生蒲黄标准汤剂分成4类，PH-04、PH-05、PH-07、PH-08为一类，PH-01～PH-03、PH-10～PH-12为一类，PH-06和PH-09与其他样品差异较大，单独列为两类。

表5 生蒲黄标准汤剂主成分分析特征值及方差贡献率

表6 各共有峰旋转后的成分矩阵

表7 各共有峰成分得分系数矩阵

图5 生蒲黄标准汤剂主成分分析得分图

3 讨论

标准汤剂与中药饮片临床应用基本属性一致，同时能解决配方颗粒等用药形式性状缺失条件下的质量控制难题。本研究基于传统煎煮工艺，按照《技术要求》和《中药饮片标准汤剂研究策略》[7]推荐的制法制备标准汤剂，建立生蒲黄标准汤剂的制备方法，测定标准汤剂中香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量，香蒲新苷转移率为79.41%±13.9%，异鼠李素-3-O-新橙皮苷转移率为58.66%±18.8%，出膏率为9.5%～14.5%，pH值为5.4～6.4；建立了标准汤剂HPLC指纹图谱，确认了7个共有峰，通过对照品比对指认出2个色谱峰，并通过聚类分析和主成分分析，提出对生蒲黄饮片分类的方法。

水烛香蒲主要分布于江苏、浙江、山东、安徽、湖北等省，东方香蒲产于贵州、山东、山西、东北各省[10]。蒲黄产地分布广泛，几乎遍布全国[11]。本研究样品来自不同产地、不同厂家，基本能够代表目前市售药材的实际情况。12批饮片中香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷总含量为0.58%～0.97%，符合2015年版《中华人民共和国药典》（一部）要求（总含量≥0.5%）。

蒲黄药用部位为花粉。花粉、细小种子等细粉类药材临床使用时一般选择包煎，否则可能漂浮于水面上，不利于有效成分的煎出，或汤剂中有细小颗和绒毛，刺激咽喉[12]。但我们发现，蒲黄浸泡后混悬于水中，未呈现漂浮状态，能保证充分提取其有效成分，而且本工艺制备的标准汤剂中无细小颗粒或绒毛，故未采用包煎方法。此制备方法符合中医药传统理论和临床应用情况，满足工艺标准化、统一化的要求，可作为临床使用的最低标准，为中药配方颗粒、经典名方、中药整体质量控制提供参考。

蒲黄有水烛香蒲、东方香蒲等多个基源，从饮片形状上很难鉴别，基源的多样性可能导致多批样品指纹图谱相似性低。本研究除PH-09外，其余11批样品与对照图谱的相似度均大于0.9。分析数据发现，PH-09饮片和标准汤剂中香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷的含量均低于其他样品，可能由于此样品质量虽然符合药典标准，但低于市场上饮片的平均质量水平所致。

由标准汤剂中香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量测定结果可知，不同产地样品之间2种黄酮苷成分含量差异较大，产自内蒙古的饮片中2种黄酮苷总含量平均值高于江苏和山东饮片，这一结果与文献报道[13]相似。但以2种黄酮苷色谱峰面积为变量对12批样品进行聚类分析或主成分分析，结果均未发现样品质量与产地之间的相关性。可能除产地因素外，其他如基源、药材贮存时间等因素对样品质量亦有影响。聚类分析、主成分分析与指纹图谱相结合，可为评价蒲黄饮片及其制剂的质量提供参考。本研究结果未显示出道地产区江苏所产蒲黄[14]较其他样品的优越性。

样品的传统鉴定与DNA条形码相结合，可以精确到物种，比较不同基源的饮片差异[7]。本研究未对样品进行基源鉴定至物种，基源对蒲黄饮片质量的影响尚未可知。蒲黄成分复杂，其物质基础是多种成分构成的，仅用香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷作为指标成分，多数共有峰未确认，可能存在片面性，今后可选择液质联用、核磁共振氢谱等方法对蒲黄饮片中的化学成分进行指认。临床中还可以蒲黄细粉直接制成散剂口服或外敷[15]，标准汤剂能否作为外敷用药的标准有待商榷。另外，与生蒲黄相比，蒲黄炭黄酮苷类成分减少，鞣质类成分增加，鞣质与热解为苷元的黄酮类成分为蒲黄炭的主要有效成分[16]，因此，蒲黄炭的标准汤剂应与生蒲黄有所差异。

综上，本研究遵从传统水煮工艺，依托现代检测手段，制定了生蒲黄标准汤剂的质量评价方法，可为蒲黄配方颗粒等其他口服汤剂的质量控制提供依据。