六味地黄汤治疗新生儿缺血缺氧性脑病lncRNA-miRNA-mRNA转录网络整合分析

陈博威，郑飘，易健，刘柏炎，3

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007； 3.益阳医学高等专科学校，湖南 益阳 413000

新生儿缺血缺氧性脑病（neonatal hypoxic- ischemic encephalopathy，HIE）是围产期常见疾病，可导致婴儿脑瘫、癫痫等神经系统疾病甚至死亡。目前西医以亚低温及神经营养治疗为主[1]。中医在整体观念和辨证论治原则指导下，其多环节、多靶点、整体调节方式在HIE疗效与安全性方面具有一定优势。六味地黄汤为传统补肾名方，具有调节细胞凋亡、代谢、增殖的作用[2]。本课题组前期通过对“肾通于脑”理论进行挖掘，认识到肾在脑的生长发育过程中占有重要地位，为六味地黄汤治疗HIE提供了理论基础[3-5]。临床研究显示，六味地黄汤可改善脑血流量、降低血黏度[6]。但既往研究均针对单一靶点与单一机制，无法系统阐明六味地黄汤治疗HIE的分子机制。 目前，由长链非编码RNA（lncRNA）、微小RNA（miRNA）及mRNA组成的转录网络越来越受到重视。lncRNA不能直接编码翻译蛋白质，但在转录后水平上，可作为竞争性内源RNA（ceRNA），通过特异性海绵吸附miRNA的方式，间接减少miRNA与下游靶基因的结合，从而实现对基因的调控[7]。既往研究发现，lncRNA在中枢神经系统中特异表达，并广泛参与对大脑发育、神经分化、突触可塑性、认知与记忆功能的调控[8]。目前，lncRNA及miRNA的表达谱已在HIE疾病中被发现，提示其可能对HIE的疾病发展起重要作用[9-10]。基于前期研究认识，本研究通过生物信息学手段，辅以网络药理学和分子对接技术，挖掘六味地黄汤治疗HIE的活性成分-靶点网络及lncRNA-miRNA-mRNA三元转录网络，以期阐明该方多途径、多靶点协同作用的分子机制，并为后续基础和临床研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 六味地黄汤活性成分筛选与作用靶点预测

运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）获取六味地黄汤组方药物熟地黄、山药、茯苓、山茱萸、牡丹皮、泽泻的活性成分。依据药物的药动学特性，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为条件[11]筛选活性成分。在该数据库中输入各活性成分，查询其潜在作用靶点，并通过Perl软件（https://www. perl.org）将靶点导入Uniprot数据库（http://www. uniprot.org），获取靶点官方基因名。

1.2 疾病差异表达lncRNA、miRNA、mRNA挖掘

从基因表达数据库（GEO，https://www.ncbi.nlm. nih.gov/geo）下载编号为GSE121178的基因原始矩阵文件，该基因数据来自扬州大学，包含3个HIE新生儿的全血标本和3个正常新生儿的全血标本，基因芯片平台为GPL22120（http://www.affymetrix.com）。通过Perl软件和R语言（https://www.r-project.org），以Log2（FC）的绝对值＞1.5和P＜0.05为筛选条件进行基因数据挖掘，得出差异表达lncRNAs。借助Mircode数据库（http://www.mircode.org）预测lncRNA结合的miRNA。将得到的miRNA结果映射到miRDB（http://mirdb.org）、miRTarBase（http://mirtarbase.mbc. nctu.edu.tw）、TargetScan（http://www.targetscan.org）数据库，预测miRNA靶向调控的mRNA。

1.3 活性成分-靶点网络及lncRNA-miRNA-mRNA转录网络构建

通过Perl软件将HIE疾病预测的mRNA与六味地黄汤预测靶点取交集，得到六味地黄汤治疗HIE可能涉及的活性成分及关键lncRNAs、miRNAs、mRNAs，运用Cytoscape3.7.0软件构建活性成分-靶点网络及lncRNA-miRNA-mRNA三元转录网络。将上述关键mRNAs输入STRING数据库（https://string-db.org/），并将物种设定为“homo sapiens”，最低互作得分设置为0.4，得到蛋白相互作用网络。

1.4 关键作用靶点GO功能及KEGG通路富集分析

运用R语言Biomanager、ClusterProfiler软件包对得到的关键靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析。GO功能富集分析可描述基因产物可能形式的分子功能、参与的生物过程和所处的细胞环境。KEGG通路富集分析通过将已知的基因组注释信息进行分类，得出最显著的生物学过程。

1.5 分子对接分析

先用ChemOffice16.0软件将六味地黄汤主要活性化合物的3D结构保存为.mol2格式并使其能量最小化。从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载主要靶点3D结构.pdb格式，运用PyMOL软件（https:// www.pymol.org）对蛋白进行去水、加氢等操作，利用Auto Dock 4.2软件将化合物及靶蛋白格式转换为.pdbqt格式，最后进行分子对接。一般认为，结合能＜-5 kcal/mol时，配体与受体可实现较好结合[12]。

2 结果

2.1 六味地黄汤活性成分及作用靶点

通过TCMSP和Uniprot数据库得到六味地黄汤活性成分，其中熟地黄2个、山茱萸13个、山药12个、牡丹皮6个、泽泻7个、茯苓6个，合并重复项后得到活性成分41个，潜在作用靶点194个，见表1。

表1 六味地黄汤活性成分

2.2 疾病差异lncRNA、miRNA、mRNA

基于GSE121178的基因芯片共得出217个差异基因（见图1A），运用Perl软件筛选出31个差异lncRNAs（见图1B）。将差异表达的31个lncRNAs输入Mircode数据库，预测到546个lncRNA-miRNA的调控关系。通过miRDB、miRTarBase、TargetScan数据库预测得到miRNA的靶向mRNA。为保证结果可靠，本研究仅选取被3个数据库同时预测到的共1 900个miRNA-mRNA调控关系。

图1 HIE疾病GEO芯片差异表达基因

2.3 活性成分-靶点网络及lncRNA-miRNA-mRNA转录网络

将预测到的靶向mRNAs与六味地黄汤作用靶点取交集，得到有效成分33个，药物-疾病关键lncRNAs 13个，关键miRNAs 20个，关键mRNAs 33个。运用Cytoscape3.7.0软件构建活性成分-靶点网络，见图2。活性成分按节点度大小依次有槲皮素（Quercetin，MOL000098）、山柰酚（Kaempferol，MOL000422）、(+)-儿茶素（(+)-Catechin，MOL000492）、薯蓣皂苷元（Diosgenin，MOL000546）等，见表2。由13个关键lncRNAs、20个关键miRNAs、33个关键mRNAs构成的三元转录网络见图3。其中，H19与miR-17-5p分别在lncRNA组及miRNA组的靶基因数目最多，见表3。借助STRING数据库，隐去无相互作用的蛋白后，绘制包含31个节点和198条边的蛋白相互作用网络，其中，节点度居前列的核心作用基因有MYC、JUN、VEGFA、CCND1、ESR1、MAPK1、PTGS2、FOS、MAPK8、CDKN1A等，见图4。

图4 六味地黄汤治疗HIE蛋白相互作用网络与核心作用基因

表3 六味地黄汤治疗HIE三元转录网络主要基因及其靶点

图2 六味地黄汤活性成分-靶点网络

表2 六味地黄汤主要活性成分节点度

图3 六味地黄汤治疗HIE lncRNA-miRNA-mRNA转录网络

2.4 关键靶点富集分析

对关键靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析，共获得679个GO功能富集结果，其中分子功能主要富集在转录因子活性与DNA、RNA聚合酶活性等，生物过程主要富集在对激素、氧浓度反应等，细胞组分主要富集在RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物及核转录因子复合物上。KEGG通路富集分析得到107条通路，主要包括PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路及Wnt信号通路。此外，还可能涉及调控细胞衰老、细胞周期及细胞凋亡等，提示六味地黄汤治疗HIE与多条通路、多个生物过程有关。见图5、表4。

表4 六味地黄汤治疗HIE关键靶点KEGG通路富集分析主要通路及相关基因

图5 六味地黄汤治疗HIE关键靶点GO功能及KEGG通路富集分析

2.5 分子对接结果

将六味地黄汤治疗HIE节点度值排名居前列的槲皮素、山柰酚、(+)-儿茶素及薯蓣皂苷元等活性成分与主要KEGG通路PI3K-Akt信号通路的2个标志蛋白PIK3CA（PBD ID：2RD0）、AKT1（PBD ID：1H10-1）进行分子对接。结果显示各活性成分与PIK3CA、AKT1的结合能均小于-5 kcal/mol，表明其均能与靶点较好结合，其中薯蓣皂苷元分别与2个靶点的结合能最低，见表5、图6。

表5 六味地黄汤中主要活性成分的分子对接结合能

图6 薯蓣皂苷元与PIK3CA、AKT1分子对接示意图

3 讨论

HIE发病机制较为复杂，其脑损伤为多重因素、多种机制交互作用发生的“瀑布式”病理变化，包括神经细胞能量代谢障碍、神经炎性毒性损伤等[1]，因此单一药物或措施无法逆转其病理改变。中药具有多组分、多靶点的特点，能够对疾病的不同病理环节发挥协同作用，为治疗HIE提供了新思路。根据HIE临床表现，可将其归属中医学“初生不啼”“胎搐”等范畴，主要病机为先天精血亏虚，胎元不足。基于“肾藏精，精生髓，髓聚脑”的“肾脑相关”理论，治以补肾固本、填精益髓，六味地黄汤为代表方剂。既往研究表明，六味地黄汤能清除HIE大鼠脑组织内的氧自由基，并能通过调控低氧诱导因子-1α的基因表达，促进HIE大鼠病变脑组织的修复[13]。

本研究发现，六味地黄汤中槲皮素、山柰酚、(+)-儿茶素及薯蓣皂苷元等活性成分与HIE疾病密切相关，另外通过STRING数据库发现MYC、JUN、VEGFA、CCND1、ESR1及MAPK1等可能是蛋白相互作用网络的关键蛋白。相关研究亦证实了上述成分及靶点的作用，如槲皮素能抑制HIE大鼠的神经细胞凋亡，并促进神经再生[14-15]；山柰酚具有抑制神经炎性损伤及保护血脑屏障的作用[16]；(+)-儿茶素能通过改善能量代谢及拮抗神经毒性的方式，改善缺血缺氧神经元活性[17]；薯蓣皂苷元能通过抑制小胶质细胞活化降低炎症反应，减轻脑损伤[18]。关键蛋白中的FOS与MAPK1属于应激蛋白激酶，在神经系统信号转导中具有重要作用，广泛参与神经细胞的生长和分化等生理过程[19]。CCND1属细胞周期家族，具有调控细胞生长、分裂与死亡的作用[20]。VEGFA为血管内皮生长因子家族成员，与大脑缺血缺氧后的血管新生密切相关[21]。ESR1是一种雌激素受体，有研究表明ESR1具有维持神经系统正常功能的作用[22]。此外，分子对接结果显示主要活性成分均能与标志靶点较好结合，一定程度上验证了本研究的准确性。

在KEGG通路富集分析结果中，居前列的PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路是大脑缺血缺氧后的重要调控通路，与氧化应激、炎症反应及凋亡等病理过程密切相关[23-24]。PI3K-Akt通路是调控细胞生长、代谢及存活的经典通路，并且广泛参与了许多中枢神经系统疾病[25]。研究表明，HIE新生兔模型中PI3K-Akt通路被激活，并抑制神经元的凋亡[26]，阻断PI3K-Akt通路则会诱导脑内炎症反应及细胞凋亡，加重神经功能损害[27]。有实验显示，在脑缺血后活化的MAPK通路会激活Nrf2通路，而补肾中药能够抑制MAPK通路的磷酸化，扭转Nrf2核移位，减少氧化应激[28]；亦有研究发现，MAPK信号通路与炎症反应密切相关，其在大脑缺血后可激活下游的NF-κB通路，促进炎症反应[29]，而抑制MAPK通路活化则可以减轻炎症反应，具有神经保护作用[30]。此外，IL-17信号通路、TNF信号通路为脑损伤后主要的炎症反应通路[31]。前期研究显示，脑损伤后会导致脑内炎症“级联反应”产生，而六味地黄汤能够抑制炎症反应，减轻脑损伤[4]。Wnt信号通路则是脑损伤后神经再生的重要调控通路[32]。综上，六味地黄汤治疗HIE的作用机制与多条通路、多个生物过程存在一定的联系，这与中医标本兼治的整体观念相吻合，同时体现了中药复方多靶点、多环节的治疗特点。

基于生物信息学技术，本研究初步构建了六味地黄汤治疗HIE的lncRNA-miRNA-mRNA转录网络，其中，H19和miR-17-5p分别在lncRNA组及miRNA组节点度值最高，且miR-17-5p可以靶向调控KEGG通路富集居前列的PI3K-Akt通路及MAPK通路中MAPK1、CCND1、CDKN1A等多个基因。lncRNA H19与中枢神经系统联系密切，有研究显示其在大脑缺血后表达显著增加，并且与美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）评分及肿瘤坏死因子-α表达水平呈正相关[33]；敲除lncRNA H19则会抑制脑缺血后的炎症反应，并促进神经再生[34]。lncRNA H19还能作为ceRNA海绵吸附miR-17-5p[35]，且敲除lncRNA H19可上调miR-17-5p的表达[36]。miR-17-5p不仅能在脑缺血后抑制下游PTEN基因表达进而磷酸化PI3K-Akt通路，发挥神经保护作用[37]，还能通过抑制下游p38-MAPK表达水平，减少HIE大鼠的神经细胞凋亡[38]。此外，有研究显示miR-17-5p能够通过抑制炎症反应等方式促进HIE大鼠的神经修复[39]。上述研究表明，lncRNA H19/miR-17-5p网络是一个与中枢神经系统的保护及修复有密切联系的调控网络，据此推测六味地黄汤治疗HIE过程中，lncRNA H19可能作为ceRNA海绵参与miR-17-5p对下游各类基因的调控，进而具有影响神经修复的作用。

综上所述，本研究运用生物信息学及网络药理学方法，初步探讨了六味地黄汤治疗HIE的有效成分及其潜在作用靶点，并构建了lncRNA-miRNA-mRNA三元转录网络，发现靶基因与大脑缺血缺氧后的氧化应激、炎症反应及凋亡等病理过程密切相关，还预测lncRNA H19/miR-17-5p轴可能是其重要ceRNA调控轴，并进行了分子对接验证，可为六味地黄汤的临床运用和实验研究提供依据和方向。考虑到中药活性成分在煎煮过程中及进入体内可能发生的复杂变化，有必要通过后续实验进一步验证。