基于网络药理学和分子对接研究黄连温胆汤 治疗痰热内蕴型阻塞性睡眠呼吸暂停综合征作用机制

包君丽，高欣元，张可，韩宇博，彭坤明，刘莉

1.青海大学，青海 西宁 810016；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150036； 3.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150036；4.中国科学院大学深圳医院，广东 深圳 518106

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）是由于睡眠时反复上气道塌陷，造成上气道阻塞，引起呼吸暂停和通气不足，伴有打鼾、睡眠结构紊乱、睡眠缺陷、低氧血症、日间嗜睡、晨起头痛等症状的综合征。OSAS可导致高血压、胰岛素抵抗、心肌梗死、中风、心房颤动、心脑肺血管并发症甚至多脏器损害，严重影响患者的生活质量和寿命[1]。持续气道正压通气治疗是OSAS最常用和最有效的治疗方法，但不良反应较多、依从性差，使其临床应用受限[2-3]。根据OSAS临床症状，可将其归属于中医学“鼾症”范畴，中医治疗该病有丰富经验，相关研究取得了一定进展[4]。临床研究表明，黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS疗效显著[5-7]。黄连温胆汤出自陆廷珍《六因条辨》，用于治疗病机为湿热或痰热的病症，其寒温并用，苦寒清热降浊，辛温燥湿通阳，苦降辛通，和阴阳而畅气机，达湿热、痰热分消之势[8-10]。然而，黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS的作用机制尚未明确。

网络药理学基于系统生物学，对药物治疗疾病的多成分、多靶点、多途径网络关系进行分析，阐释药物作用机制，可为中医药研究及应用提供方向[11]。分子对接是通过研究分子间（如配体和受体）相互作用，预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法[12]。本研究运用网络药理学方法筛选黄连温胆汤的有效活性成分，预测其治疗痰热内蕴型OSAS的相关靶点和通路，构建疾病-药物-成分-靶点网络，探讨黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS的可能作用机制，并利用分子对接技术对黄连温胆汤活性成分与痰热内蕴型OSAS关键靶点蛋白进行模拟结合研究。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分收集

利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/TCMSP.php）[13]，以黄连温胆汤组方药物“黄连”“枳实”“茯苓”“竹茹”“半夏”“橘红”“甘草”“生姜”为关键词，在“Herb name”条目中检索其化学成分，设定药物筛选阈值为口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18，获得黄连温胆汤的有效化合物成分信息。利用中医药综合数据库（TCMID，http://183.129.215.33/TCMID/ search/）[14]检索TCMSP未收录的化合物成分。

1.2 活性成分候选靶点对应基因收集

对TCMSP收集的化合物，通过TCMSP获取靶点蛋白名称；对TCMID收集的化合物，通过STITCH数据库（http://Stitch.embl.de/）[15]寻找相应靶点蛋白。利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）[16]获取靶点对应基因名称及UniProtKB。

1.3 疾病相关靶点基因收集

通过PubMed数据库（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/pubmed/）查询“阻塞性睡眠呼吸暂停综合征”的主题词，分别为“obstructive sleep apnea”“obstructive sleep apnea syndrome”“obstructive sleep apnea hypopnea syndrome”，检索GeneCards（https://www. genecards.org/）[17]、OMIM（https://omim.org/）[18]数据库，将得到的基因进行整合，作为OSAS疾病基因。 参照《鼾症中医诊疗专家共识意见》[19]拟定痰热内蕴型OSAS辨证标准：①呼吸急促、鼻息灼热；②口干、口渴、口臭；③小便短赤、大便秘结；④舌红、苔黄腻、脉滑数。通过GeneCards数据库，分别以“shortness of breath”“burning nose”“dry”“thirst”“halitosis”“short redurine”“stool constipate”“red tongue”“yellow and greasy tongue coating”“pulse slip number”为关键词检索对应基因，并将其按辨证标准分为4组，分别进行组内基因去重，再组间合并，最后与OSAS疾病基因进行整合，即为痰热内蕴型OSAS疾病基因。利用R语言的VennDiagram函数将痰热内蕴型OSAS疾病基因与黄连温胆汤主要活性成分对应的靶点基因取交集，获取共有基因，作为黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS的潜在作用靶点。

1.4 活性成分-作用靶点网络构建与分析

剔除重复及与疾病无相关性的靶点，将剩余的药物活性成分与治疗痰热内蕴型OSAS的潜在作用靶点及相关通路构建数据表，导入Cytoscape3.7.2软件，构建活性成分-靶点网络，展示药物活性成分与治疗痰热内蕴型OSAS靶点间的关系。

1.5 靶蛋白相互作用网络构建

将黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS的潜在作用靶点导入STRING数据库（https://string-db.org/）[20]，获取蛋白相互作用关系，将数据导入Cytoscape3.7.2软件进行可视化处理，通过cytoNCA插件计算度中心度（DC）、中介中心度（BC），用于衡量拓扑网络的重要性。

1.6 GO分析及KEGG通路富集分析

将黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS的潜在作用靶点基因利用R语言的Clusterprofiler程序包进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，设定P≤0.05，得到相应的生物过程（BP）及KEGG通路。将所得KEGG数据导入Cytoscape3.7.2软件，进行可视化图形绘制。

1.7 分子对接

从PDB数据库（http://www.pdb.org/）下载黄连温胆汤重要化合物结合的候选蛋白质的晶体结构，并用MOE软件进行修饰，以去除配体、添加氢、去除水、优化和修补氨基酸，并使所有候选靶点的能量最小化。使用MOE测试黄连温胆汤化合物与候选靶蛋白之间的对接精度，因其具有较高的准确性和一致性。最佳对接姿态为预测构象与观测X射线晶体构象的均方根偏差（RMSD）最小。RMSD≤4Å的模型被认为是可靠的，RMSD≤2Å的模型被认为是准确的。整体评估的综合得分越小，表示分子之间的结合能越小，两者之间有较好的结合性（一般小于-5）。同时，用不同颜色标记小分子结构，若两者之间的结构空间有较大的重复区域，则表明小分子构象与配体之间的相似性较大。

2 结果

2.1 黄连温胆汤候选活性成分

通过TCMSP数据库检索得到活性成分分别为黄连14个、枳实22个、茯苓15个、半夏13个、橘红9个、生姜5个、甘草92个，检索得到相应靶点。通过TCMID数据库检索到竹茹3个活性成分organic acids、glucides、aminoacids，通过STITCH数据库检索得到相应靶点。剔除重复和无靶基因的活性成分，共计134个。

2.2 黄连温胆汤治疗痰热内蕴型阻塞性睡眠呼吸暂停综合征候选靶点

通过UniProt数据库获得黄连温胆汤244个候选靶点的相应基因。通过GeneCards数据库得到OSAS相关基因1 929个，OMIM数据库得到OSAS相关基因623个，去重后得到OSAS相关基因2 551个。再将痰热内蕴型基因与OSAS相关基因取交集，获得痰热内蕴型OSAS靶点基因1 869个。将黄连温胆汤候选靶点与痰热内蕴型OSAS候选靶点比对筛选，得到可能与痰热内蕴型OSAS有关的作用靶点118个。

2.3 疾病-药物-成分-靶点网络

将黄连温胆汤药物活性成分和痰热内蕴型OSAS相关靶点通过Cytoscape3.7.2软件构建疾病-药物-成分-靶点网络，见图1。该网络包括290个节点（134个活性成分，118个作用靶点）和2 186条边。可以看出，黄连温胆汤通过多成分对应多靶点发挥对痰热内蕴型OSAS的治疗作用。

图1 黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS疾病-药物-成分-靶点网络

2.4 靶蛋白相互作用网络

通过STRING数据库获取黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS潜在作用靶点基因的蛋白相互作用关系，并通过Cytoscape3.7.2进行可视化，结果见图2。该网络共有118个节点、2 104条边，DC值介于1～65，DC平均值为35.66，BC值介于0～691（图2A）。选择DC＞45的节点，共39个（图2B绿色节点），生成子网络（图2C）。进一步选择DC＞16的节点，共计10个（图2C绿色节点），可认为这些靶点与黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS相关性较大。

图2 黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS靶蛋白相互作用网络

2.5 GO生物过程及KEGG通路

GO富集分析结果显示，生物过程（BP）主要有对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、对细菌来源分子的反应（response to molecule of bacterial origin）、对营养水平的反应（response to nutrient levels）、氧化应激反应（response to oxidative stress）、对养分的反应（response to nutrient）等，见图3。

图3 黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS关键靶点GO富集分析（BP）

KEGG通路富集分析得到153条通络，为准确了解黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS的作用机制，设置富集到相应通路的基因比例≥13.16%，将所得数据P值取对数后导入Cytoscape3.7.2进行可视化，结果见图4。结合文献找出可能与治疗痰热内蕴型OSAS相关的通路，并将其与痰热内蕴型OSAS靶点结合，得到关键靶点KEGG通路（见表1）。

表1 黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS关键靶点KEGG通路

图4 黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS关键靶点KEGG通路富集分析

2.6 分子对接结果

通过分子对接验证黄连温胆汤候选化合物木犀草素（luteolin）、槲皮素（quercetin）、黄芩素（baicalein）与潜在靶蛋白IL6（PDB ID：6NCO）、AKT1（PDB ID：5KCV）、CASP3（PDB ID：1RHM）和MMP9（PDB ID：6ESM）之间的对接精度，见图5～图8。结果表明，靶蛋白与对应化合物分子的得分＜-5，表明靶蛋白与化合物分子之间有较好的结合性，见表2。

图5 黄连温胆汤候选化合物与IL6分子对接示意图

图6 黄连温胆汤候选化合物与AKT1分子对接示意图

图7 黄连温胆汤候选化合物与CASP3分子对接示意图

图8 黄连温胆汤候选化合物与MMP9分子对接示意图

表2 黄连温胆汤候选化合物与靶蛋白分子对接数据

3 讨论

本研究结果显示，黄连温胆汤作用于痰热内蕴型OSAS的有效活性成分共134个，对应潜在作用靶点118个。通过分析这些靶点的生物过程及信号通路，探究黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS的作用机制，可为其临床应用提供证据支持，并为进一步实验研究提供思路。

根据靶蛋白相互作用网络分析可知，黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS可能通过作用于IL（白细胞介素）-6、CASP3（半胱氨酸蛋白酶-3）、AKT1（蛋白激酶B1）、MMP9（基质金属蛋白酶9）等靶点发挥疗效。IL-6是炎症细胞因子网络的关键成分，而OSAS是一个炎症过程，这一过程可能促使上气道狭窄，使患者缺氧加重[21-23]。OSAS通过间歇性缺氧导致IL-6细胞因子释放，而IL-6介导的气道局部炎症又导致OSAS发生或加重[24]。Caspase-3活化后使细胞蛋白酶级联切割放大导致细胞凋亡，亦可直接酶解抑凋亡基因Bcl-2触发细胞凋亡。史艳红等[25]研究表明，OSAS模型组大鼠海马Caspase-3 mRNA表达过高。杨嶷芳等[26]发现，OSAS患者腭帆张肌中Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平明显高于正常人，且与呼吸紊乱指数呈正相关。周彤等[27]研究发现，OSAS模型大鼠Caspase-3蛋白表达显著升高，β-胡萝卜素可降低Caspase-3蛋白表达，提示抑制Caspase-3蛋白表达可改善OSAS临床症状。AKT1是AKT的一种亚型。杜娟等[28]利用慢性间歇低氧模拟OSAS，结果显示间歇低氧小鼠肝细胞p-AKT蛋白表达减少。庄向华等[29]利用慢性间歇低氧模拟OSAS，发现OSAS大鼠脂肪组织p-Akt蛋白水平较对照组降低。MMP-9是一种蛋白水解酶，其主要参与细胞外基质的分解。研究发现，OSAS患者血浆和血清中MMP-9表达增加，且与病情的严重程度有关[30-33]。宋爱玲[34]研究表明，慢性间断性缺氧可引起小鼠肾小管上皮细胞MMP-9表达升高，提示MMP-9可能参与了OSAS肾损害的发生发展过程。Fang等[35]Meta分析结果显示，OSAS患者MMP-9水平升高，且与OSAS严重程度有关。

通过KEGG通路富集分析可知，黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS主要涉及PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、NF-κB信号通路、HIF-1信号通路等。研究发现，OSAS的间歇性低氧会抑制PI3K/Akt通路，从而加重氧化应激、炎症反应、细胞凋亡，造成神经细胞损伤，导致认知功能障碍的发生[36]。Guan等[37]研究表明，白藜芦醇可激活慢性间歇性低氧大鼠PI3K/AKT/mTOR通路，发挥其改善心肌肥厚、氧化应激和细胞凋亡的作用。MAPK信号转导通路在炎症反应、细胞凋亡中起重要作用，其可被缺氧、炎性因子等多种胞外信号激活，参与细胞分化、凋亡、炎症反应等过程。张超等[38]研究结果显示，间歇性低氧大鼠p38MAPK mRNA及蛋白表达显著增高，其下游因子一氧化氮浓度显著降低，内皮素-1、内皮素转换酶水平显著升高，提示间歇低氧可激活p38MAPK通路。葛丽荞等[39]研究表明，p38MAPK抑制剂SB203580通过减轻软腭组织中p-p38的表达，从而减轻慢性间歇性缺氧大鼠软腭的损伤。NF-κB通路参与机体的炎症反应、免疫应答，能调节细胞凋亡、应激反应，NF-κB过度激活与OSAS密切相关。姜秋芳[40]发现，慢性间歇低氧可以通过激活NF-κB通路导致大鼠肝脏炎性损伤。郑庆等[41]发现，慢性间歇性缺氧兔主动脉内皮细胞中NF-κB表达明显升高，提示慢性间歇性缺氧可通过激活NF-κB导致兔早期动脉粥样硬化改变，NF-κB通路激活是OSAS导致冠心病的机制之一。研究表明，OSAS患者由于反复缺氧，通过激活HIF-1信号通路使下游多种因子得以表达，从而引起OSAS的合并疾病[42]。Rosa等[43]研究显示，慢性间歇低氧大鼠的HIF-1 mRNA水平显著增加。

分子对接结果表明，本研究获取的黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS的主要活性成分木犀草素、槲皮素、黄芩素与靶蛋白IL6、AKT1、CASP3、MMP9有较好的结合性。这些靶蛋白在PPI网络中处于关键位置，并参与了关键通路，提示其在治疗过程可能起关键作用。

综上所述，本研究基于网络药理学和分子对接方法，从多方面阐释了黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS的物质基础和分子机制（见图9）。可以看出，黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS具有多成分、多靶点、多通路的特点，可为其临床应用及实验研究提供思路与方向。

图9 黄连温胆汤治疗痰热内蕴型OSAS作用机制示意