草乌叶生物碱分离纯化工艺的研究

赛乌其日 新吉乐 特格喜白音 敖登其木格 乌力吉特古斯

摘要 目的：利用制备型高效液相色谱（PHPLC）研究草乌叶生物碱的分离纯化工艺为目的。方法：利用苯提取法得到草乌叶苯提取物。利用PHPLC将草乌叶苯提取物进行初步分离，分离产物用薄层色谱和分析型液相色谱分析，以确定目标峰。再次用PHPLC对目标峰进行分离和纯化，对所得各峰进行收集，薄层色谱和分析型液相色谱分析分离产物，验证分离效果。结果：草乌叶苯提取物经PHPLC初步分离后得到峰1～峰12。经薄层色谱和分析型液相色谱分析得知峰5～峰10含有大量生物碱。选择峰5作为研究对象，进一步使用PHPLC进行分离纯化，得到峰5-1～峰5-12等12个峰。薄层色谱和分析型液相色谱分析结果证明，峰5-4基本包含了峰5内的生物碱，为目标分离产物。结论：PHPLC初步分离和二次分离建立的色谱条件，可为草乌叶生物碱的大量精制提供依据。

关键词 草乌叶;生物碱;制备型高效液相色谱

A study of Alkaloids Separation and Purification Method from Leaves of Kusnezoff Monkshood Root

Saiwuqiri1，Xinjile2，Tegexibaiyin2，Aodengqimuge2，Wulijitegusi2

（1 Hang Jin banner Mongolian Medicine General Hospital，Inner Mongolia Autonomous Region，Ordos 017400，China;

2 Inner Mongolia International Mongolian Medicine Hospital，Hohhot 010010，China）

Abstract Objective：To study the alkaloids separation and purification method from leaves of kusnezoff monkshood root using Preparative High Performance Liquid Chromatography（PHPLC）.Methods：benzene extraction method was used to obtain benzene extract from leaves of kusnezoff monkshood root.PHPLC was used to separate ingredients of benzene extract from leaves of kusnezoff monkshood root.Thin layer chromatography（TLC）and High Performance Liquid Chromatography（HPLC）were used to analyze the separated ingredients and determine the target peak.PHPLC was used to purify the target peak，the peaks were collected，the separated products were analyzed by TCL and HPLC to verify the separation effect.Results：A total of 12 Peaks were collected using PHPLC separation，designated as Peak 1～Peak 12.TLC and HPLC analysis showed that Peak 5～Peak 10 were enriched in alkaloids.Peak 5 was selected as an example to receive further PHPLC separation.A total of 12 peaks were seen，defined as Peaks 5-1～Peak 5-12.TLC and HPLC illustrated that Peak 5-4 contained most of alkaloids in Peak 5，which was the target separation product.Conclusion：Chromatographic conditions established by PHPLC primary separation and secondary separation can provide basis for the large-scale extraction of alkaloids from leaves of kusnezoff monkshood root.

Keywords Leaves of kusnezoff monkshood root; Alkaloids; Preparative high performance liquid chromatography

中圖分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.006

草乌叶为毛莨科植物北乌头Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥叶。其主要成分为生物碱，草乌中起治疗作用和毒性作用的化合物均为乌头型生物碱。为常用蒙医药，《中华人民共和国药典》和《内蒙古蒙药材标准》均收载，有清热、解毒和止痛等功效，用于热病发烧、泄泻腹痛、头痛牙痛等。本研究利用制备型高效液相色谱仪分离纯化草乌叶生物碱，为了得到纯度较高的草乌叶生物提取方法碱奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 隔膜真空泵（天津津腾实验设备有限公司，型号：GM-0.33A）;华晨高速多功能粉碎机（浙江省永康市金穗机械制造厂，型号：HCP-1000A）;超纯水机（Millipore，美国，型号：Milli-Q）;BT 25S电子天平（赛多利斯，德国，型号：BT 25S）;旋转蒸发仪（IKA，德国，型号：IKA HB 10 basic）;旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂，型号：RE-52AA）;RE-52CS-1旋转蒸发器（上海雅荣生化设備仪器有限公司，型号：RE-52CS-1）;暗箱三用紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司，型号：ZF7）;数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-500DE）;数显恒温水浴锅（上海江星仪器有限公司，型号：HH-6）;制备型高效液相色谱仪（成都格莱精密仪器有限公司，型号：GL3250）;高效液相色谱仪（赛默飞世尔，美国，型号：Dionex Ultimate 3000）。

1.2 试剂 色谱纯乙腈（Fisher Scientific，美国，批号：106246）;色谱纯三乙胺（天津市致远化学试剂有限公司，批号：20140726）;色谱纯冰醋酸（Fisher Scientific Geel Belgium，美国，批号：140573）;氨水（天津市风船化学试剂科技有限公司，批号：20140408）;冰乙酸（天津市北联精细化学品开发有限公司，批号：20110908）;乙酸乙酯（天津市风船化学试剂科技有限公司，批号：20141008）;正己烷（天津市北联精细化学品开发有限公司，批号：20141120）;甲醇（天津市致远化学试剂有限公司，批号：20130316）;石油醚（天津市风船化学试剂科技有限公司，批号：20140708）;无水乙醇（天津市风船化学试剂科技有限公司，批号：20150108）;苯（天津市风船化学试剂科技有限公司，批号：20140508）;三氯甲烷（天津市北联精细化学品开发有限公司，批号：20140428）;二氯甲烷（沈阳市华东试剂厂，批号：20121222）;氢氧化钠（粒）（天津市北联精细化学品开发有限公司，批号：20120420）;碘化钾（天津市致远化学试剂有限公司，批号：20140102）;乙腈（制备级）（上海星可高纯溶剂有限公司，批号：1011241002）。

1.3 分析样品 草乌叶（亳州市光前中药材购销责任有限公司，批号：20140317）。

2 方法

2.1 草乌叶化学成分提取 将干燥的草乌叶用高速粉碎机粉碎为粉末状;将粉末状的草乌叶装5 000 mL烧杯;加入苯浸泡通风橱放置过夜;将烧杯放入超声清洗器超声30 min;静置后再次超声30 min;放置1 d后再超声30 min;旋转蒸发草乌叶苯提取物，同时回收苯;将旋转蒸发瓶内的草乌叶苯提取物溶于乙酸乙酯，倒入蒸发皿，得到草乌叶苯提取物。

2.2 草乌叶苯提取物的薄层色谱分析 将草乌叶苯提取物溶于少量乙腈，超声助溶，滤纸过滤，得到草乌叶苯提取物的乙腈溶解部分;将以上样品点样于硅胶板G。向展开缸加入10 mL展开剂。展开剂为正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇=6.4∶3.6∶1。将点好样品的薄层板放入展开缸，使样品展开。对所得结果进行日光下观察、利用ZF7型暗箱三用紫外分析仪365 nm下观察或稀碘化铋钾显色观察生物碱类化合物，拍照。稀碘化铋钾显色液的配制：碱式硝酸铋0.085 g溶于1 mL冰醋酸及4 mL水中。碘化钾2 g溶于水5 mL中。临用前将上述碱式硝酸铋溶液1 mL和碘化钾溶液1 mL放入棕色瓶。加入冰醋酸4 mL与水20 mL混合。使用时放入50 mL薄层色谱显色喷雾瓶使用。

2.3 草乌叶苯提取物的分析型高效液相色谱仪分析 使用Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪对草乌叶苯提取物进行分析。对利用制备型高效液相色谱仪初步分离和纯化的草乌叶苯提取物同乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱等标准品进行对照，色谱条件如下：柱子型号为Hypersil GOLD色谱柱;流动相为乙腈∶醋酸三乙胺=33∶67;波长为235 nm;流速为1 mL/min;进样体积为5 μL;柱温30 ℃。

2.4 草乌叶苯提取物制备型高效液相色谱仪（PHPLC）制备 利用制备型高效液相色谱仪对草乌叶苯提取物进行初步的分离和精制。色谱条件如下：制备色谱柱：（规格型号：ID 50 mm×450 mm;填料信息：12 nm-S-10 μm（反相填料）;柱子数量：1套;填料名称：日本YMC 10 μm;填装数量：300 g;填装柱长：250 mm;产品编号：GL/2014101602）;流动相为乙腈∶水=80∶20;波长为235 nm;流速40 mL/min;进样量为1 mL。

利用制备型高效液相色谱仪对草乌叶苯提取物PHPLC分离产物峰5进行进一步的分离和精制。色谱条件如下：制备色谱柱：（规格型号：ID 50 mm×450 mm;填料信息：12 nm-S-10 μm（反相填料）;柱子数量：1套;填料名称：日本YMC 10 μm;填装数量：300 g;填装柱长：250 mm;产品编号：GL/2014101602）;流动相为乙腈∶水=50∶50;波长为235 nm;流速40 mL/min;进样量为1 mL。

3 结果

3.1 草乌叶苯提取物的分析 从1 kg草乌叶可得10.5 g草乌叶苯提取物。进一步将草乌叶苯提取物进行博层色谱分析，同时与苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、次乌头碱、乌头碱、新乌头碱进行比较，观察可能存在的生物碱。结果显示，草乌叶苯提取物经过稀碘化铋钾显色后，出现较多橘黄色斑点，说明其中含有大量生物碱类。见图1。同时从结果可知，草乌叶苯提取物内不含大量的次乌头碱。另外，将草乌叶苯提取物进样于Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪，观察出峰情况。见图2。

3.2 草乌叶苯提取物PHPLC分离产物的分析 为了得到草乌叶苯提取物的有效成分，将2 kg草乌叶提取得到的草乌叶苯提取物（共21 g）进行制备型高效液相分离，制备得到12个不同的峰，分别命名为峰1峰、2…峰12。见图3。将所得各个峰收集后干燥，称取其重量，计算各峰产率。见表1。对所得的峰1～峰12进行薄层色谱分析和分析型高效液相色谱分析。薄层色谱分析显示，草乌叶苯提取物虽经制备型液相色谱初步分离，在365 nm下观察到较多荧光斑，说明其中的非生物碱类成分依然较多。见图4B。但经过稀碘化铋钾显色，发现峰5～峰10里面的生物碱含量较多，尤其是峰7和峰9。见图4C。峰1～峰12经Dionex Ultimate 3000高效液相色譜分析，结果显示，峰1～峰12与草乌叶苯提取物的图谱比较，峰数量减少，得到初步分离。见图5。图5A～图5L分别为峰1～峰12的高效液相色谱分析结果。

3.3 制备型高效液相色谱对峰5的分离和分析   从以上结果得知，草乌叶苯提取物中峰5～峰10含有较多生物碱。为了进一步分析，选择12个峰当中的峰5为实验对象进行分离纯化，也得到了12个不同峰形的分离产物。分别命名为峰5-1、峰5-2…峰5-12。见图6。用薄层色谱对峰5-1～峰5-12进行分析。同时将峰5、草乌叶苯提取物作为对照。结果显示，峰5-1～峰5-12（图7A 1～12，图7B 1～12）内的化学成分明显少于它们的对照峰5（图7A 13，图7B 13）和草乌叶苯提取物（图7A 14，图7B 14）。另外，经稀碘化铋钾显色液显色后可知，峰5-4的生物碱含量较多，即峰5中的生物碱集中于峰5-4。这说明，峰5经过制备型高效液相色谱分离后，可使生物碱类集中于峰5-4。见图7C。另外，与峰5和草乌叶苯提取物比较，各个分离产物在薄层板上的成分较简单，说明达到了进一步纯化的目的。峰5-1～峰5-12也经过了分析性高效液相色谱的分析。分析结果显示，与峰5（图5M）和草乌叶苯提取物（图8N）比较，峰5-1～峰5-12（图8A～图8L）中的成分更加简单，有些峰型呈单峰的趋势，值得进一步分离和纯化。

4 讨论

草乌叶是蒙药中常用的药材。根据学者统计，300多种蒙药方剂中使用草乌叶的就达20多种。阿敏额尔敦、巴特日-7味丸、哈图拉嘎-6味散、音达拉-15等常用蒙药方剂中均有草乌叶的存在。文献资料和实验研究显示，这些蒙药复方对特定疾病的治疗效果较好，开发价值较大。当然，揭示这些方剂的作用机制，就需要对其物质基础和药理作用的深入研究，更需要澄清单味蒙药材的有效成分和药理作用。

目前对北乌头的研究主要集中于其干燥块根，即草乌的研究，对草乌叶、草乌芽、草乌花的研究较少。蒙医理论认为，草乌叶、草乌芽、草乌花同草乌具有相同的功效，且具有小毒，使用安全性较高。因此，研究草乌叶的物质基础和药理作用，不仅能加深人们对草乌叶本身的认识，对于揭示含有草乌叶蒙药复方的药理作用和作用机制十分必要。

通过本实验中用用极性较小的苯作为溶剂，提取了草乌叶中极性小的化合物。分析结果显示，提取物内含有大量生物碱，这位我们进一步分离其含有的生物碱类提供了物质基础。但实验中使用了大量苯，经济成本高，毒性大，更不利于后期大量加工时使用。因此，对于草乌叶生物碱的提取和分离，尚需改进提取分离方案，以利于草乌叶生物碱的大量制备。

在天然药物化学研究当中，分离产物的纯度、产量、生产周期、运行成本是应当考虑的因素[14]。制备型高效液相色谱具有分辨率高、检测方便、收集产物准确等有点，已经越来越多地受到研究者的青睐[15]。本研究中，草乌叶苯提取物的分离纯化只使用了制备型高效液相色谱作为分离手段，发挥了其分离时间短、效率高的特点。本实验手段为草乌叶分离产物的大量制备提供了便捷，为这些产物的药理作用研究打下了物质基础。

生物碱类往往具有很强的生物活性，是研究者争相得到的化合物。在本实验中，草乌叶苯提取物经制备型高效液相色谱分离后产生了12个可制备的峰。其中，峰7和峰9含有大量生物碱，其次为峰5、峰6、峰8、峰10。为了验证制备型高效液相色谱分离方法的正确性并减少样品损失，首先选择峰5作为研究对象，为其他各峰的分离纯化奠定基础。对峰5的分离后也得到了12个峰，分别被命名为峰5-1、峰5-2…峰5-12。其中，峰5-4基本涵盖了峰5中所有的生物碱。因而确定了峰5内草乌叶生物碱的分离工艺。如需进一步纯化其含有生物碱的单体，尚需进一步富集。另外，实验中发现，制备型液相色谱分离得到的峰7的产率达5.6%，且生物碱含量高，液相色谱分析表现出几个明显的单峰，研究价值很高。同时，在分离工作中还发现一些含有纯度较高的非生物碱的分离段，如峰5-6，在今后的工作当中可对其进行分离。

在今后的工作当中将进一步纯化以上分离产物。由于制备型高效液相色谱二次分离后，分离产物内化合物种类较少，纯度较高，适合使用简单方法大量富集。置于如何精制，需进一步研究和确定。

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（2019-08-06收稿 责任编辑：王明）

基金项目：国家自然科学基金项目（81360578）

作者简介：赛乌其日（1991.02—），男，本科，蒙药师，研究方向：蒙药药理学及新药研发相关工作，E-mail：xiangxin.jiayou@163.com

通信作者：特格喜白音（1975.12—），男，博士，主任医师，研究方向：肿瘤分子病理学，分子蒙医学，E-mail：tegexibaiyin@hotmail.com