超滤纳滤联用优化益母草生物碱的浓缩工艺

李存玉+马赟+刘奕洲+李红阳+顾佳美+彭国平

[摘要]采用超滤纳滤联用技术浓缩益母草中生物碱，通过响应面法建立二次回归模型，优化浓缩工艺。实验表明通过超滤预处理，益母草水提液中总蛋白去除率9438%，纳滤技术相较于传统热浓缩优势明显，益母草生物碱的最佳浓缩工艺为截留相对分子质量450，pH 307，盐酸水苏碱质量浓度8015 mg·L-1，总生物碱质量浓度28573 mg·L-1，在此条件下，盐酸水苏碱和总生物碱的截留率分别为9337%，9585%，相对误差为079%，116%，BoxBehnken试验设计方法可以用于益母草生物碱的浓缩工艺优化，纳滤浓缩为热敏性中药成分的分离精制提供技术支撑。

[关键词]生物碱； 益母草； 盐酸水苏碱； 纳滤； 浓缩； 超滤

益母草为唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt的新鲜或干燥地上部分，具有活血调经，利尿消肿，清热解毒的功效[1]，通过处方调剂广泛用于临床，如益母草颗粒、新生化颗粒等[23]。生物碱是益母草的主要药效成分，其中指标性成分水苏碱和益母草碱在光照和长时间加热条件下均会降解，影响制剂质量的同时也是药用资源的浪费，同时此技术难题在制药行业中也难以避免[4]。膜分离技术在制药行业中应用日趋广泛，其中纳滤具有分离过程无热效应，能耗低等优点[56]，超滤可以去除大分子杂质而对小分子目标成分影响较小，由于膜组件串联应用在中药行业尚处于摸索阶段[7]，本文探索超滤纳滤联用优化益母草中生物碱的纳滤浓缩参数。响应面法（response surface methodology，RSM）是采用多元二次回归方程拟合各因素与响应值之间的函数关系，对回归方程的分析而寻找最佳工艺参数，从而解决多变量问题的一种统计方法[89]。本文旨在单因素考察的基础上[10]，以益母草中盐酸水苏碱和总生物碱为指标，开展益母草水提液浓缩工艺研究，为含有热敏性成分的中药浓缩提供数据基础。

1材料

益母草药材购自安徽亳州，批号20151005，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为唇形科植物益母草L japonicus的干燥地上部分。

复合聚酰胺纳滤膜，截留相对分子质量100，450，800，购自南京拓鉒医药科技有限公司；聚醚砜超滤膜，截留相对分子质量1万，5万，10万，购自南京拓鉒医药科技有限公司；盐酸水苏碱对照品（批号110773201313，纯度≥98%），购自中国食品药品检定研究院；BCA蛋白含量检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

Waters e2695 高效液相色谱仪，蒸发光散射检测器，購自美国Waters公司；TNZ1纳滤分离设备（南京拓鉒医药科技有限公司）；T6紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；KH250B型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；PB10型pH计（德国Sartorius公司）；苏泊尔电磁炉（型号SDHC8E15210，浙江苏泊尔股份有限公司）。

2方法

21益母草水提液制备

称取益母草药材10 kg，按照体积质量比，分别加入10，8倍纯化水提取2次，每次1 h，提取液使用045 μm微孔滤膜过滤，合并滤液，即得。

22超滤去除大分子

为提高纳滤分离效率、减轻膜组件污染，采用超滤去除益母草提取液中的蛋白等大分子物质。取益母草水提液，分别采用截留相对分子质量1万，5万，10万超滤膜过滤，以盐酸水苏碱、总生物碱和总蛋白质含量的动态变化为指标，筛选超滤参数。

23纳滤分离单因素考察

按照实验参数要求选择纳滤膜，组装纳滤浓缩装置，取益母草超滤液（2 L）置于纳滤系统中进行循环平衡，待盐酸水苏碱在纳滤膜中的吸附解吸附达到平衡时，取样平衡液，进而将溶液进行纳滤，待纳滤完成后，取样纳滤液。

为了排除纳滤分离过程中膜吸附对益母草中盐酸水苏碱等生物碱类成分的影响，同时确定纳滤分离环境参数，以盐酸水苏碱和生物碱含量变化为指标，选择药液平衡体积、溶液温度、操作压力对益母草超滤液的纳滤浓缩效果进行单因素试验，具体参数。

3结果与分析

31超滤去除大分子去除效果比较

3种截留相对分子质量的超滤膜对益母草提取液中成分的分离情况对比见表3。

盐酸水苏碱相对分子质量为1795，在3种孔径的超滤膜中的透过率均高于98%，损失不明显。益母草总生物碱随着超滤膜孔径增大，透过率明显升高，其中在1万时损失超过10%，说明益母草表3不同截留相对分子质量超滤膜对益母草中生物碱和蛋白的分离效果

截留相对

分子质量透过率盐酸水苏碱总生物碱总蛋白1万987488611765万9937972656210万992699041445

中含有部分大分子或者多分子缔合态形式存在的生物碱类成分。超滤技术在益母草水提液中的蛋白的去除方面优势明显，1万的超滤膜的蛋白的去除率高达98%以上，但随着超滤膜截留相对分子质量的增大，其透过率逐步升高，去除效果下降。在去除益母草水提液中大分子物质的同时，保证生物碱类成分有效保留，选择截留相对分子质量为5万的超滤膜对益母草水提液进行预处理。

32单因素考察结果

321药液循环平衡体积对纳滤截留率的影响

在纳滤平衡过程中，随着益母草超滤液中生物碱类成分与纳滤膜接触，药液中盐酸水苏碱和总生物碱的浓度均随着膜吸附而逐步降低，见表4，当平衡体积达到8 L时，溶液中生物碱浓度逐步稳定，说明此时生物碱类成分与纳滤膜之间的“吸附解吸附”达到平衡状态[12]，与此同时盐酸水苏碱和总生物碱在450纳滤膜中的截留率也趋于稳定，因此选择药液平衡体积需大于8 L，可以保障纳滤分离结果的重现性和准确性。

4小结与结论

中药制药过程中通过加热浓缩制剂中间体是常用技术手段，因此在加热过程中出现的氧化反应、聚合反应和美拉德反应等是难以避免的，生产能耗增加的同时直接导致中药资源浪费。此外，加热浓缩过程中成分存在状态、浓度以及成分间相互作用的差异性均与其稳定性相关[15]，因此仅选择加热温度、指标性成分浓度等作为浓缩控制参数难以保障制剂中间体的质量的均一性。因此在中药制药过程中寻找可以替代或者部分替代热浓缩技术已迫在眉睫，在以益母草提取液的纳滤浓缩工艺摸索中，以总生物碱和盐酸水苏碱为指标，在保障生物碱得到充分截留的同时，益母草黄酮、萜类、糖类等成分仍然保留在提取液溶液中，因此纳滤技术可以用于中药制剂生产的浓缩环节，而针对中药中某一类成分富集的选择性较差，需要和树脂等分离技术联用才能达到预期精制目的。

膜分离技术具有分离参数易控、分离行为重现性、参数可线性放大等技术优势，基于此本论文选择临床常用中药制剂中的益母草，结合膜分离技术优势，以盐酸水苏碱，总生物碱、蛋白含量为指标，考察超滤预处理参数，以及纳滤浓缩时药液循环体积、溶液温度、操作压力、膜截留相对分子质量、药液浓度和pH对益母草中生物碱类成分的截留率，益母草生物碱在碱性至中性溶液环境中，多以游离态或部分离子态的形式存在，因此在进行纳滤浓缩时，多依靠膜分子筛分效应进行分离，随着溶液pH降低，生物碱以解离态形式存在比例增加，且复合聚酰胺材质纳滤膜表面荷负电，成分与膜表面的电荷效应增强而难以通过纳滤膜，从而截留率升高，提升了纳滤效果。

采用响应面分析法中的BoxBehnken模式，对纳滤浓缩参数进行优化筛选，数学模型拟合程度高，实验误差小，可用于实际预测。得到优化工艺条件为：截留相对分子质量450，pH 307，盐酸水苏碱质量浓度8015 mg·L-1，总生物碱质量浓度28573 mg·L-1，在此条件下盐酸水苏碱和总生物碱的截留率分别为9337%，9585%。在实验开展的同时，对比了常压热浓缩，发现在相同溶液环境下，采用85 ℃减压热浓缩至相同比重，盐酸水苏碱和总生物碱的保留率分别为7284%，8742%，说明采用纳滤浓缩益母草提取液相较于传统工艺优势明显。但是纳滤对分离对象的黏度具有一定要求，富含多糖等成分的高黏度中药水提液纳滤浓缩效率偏低，而传统热浓缩不受此项限制，也导致目前纳滤技术在中药浓缩应用中尚有一定的局限性。

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2017年1月 第42卷第1期Vol42， No 1January， 2017

[收稿日期]20160907

[基金项目]国家自然科学基金面上项目（81274094）；国家“重大新药创制”科技重大专项 （2012ZX09103201041）

[通信作者]*朱春燕，研究员，博士生导师，研究方向为新型给药系统，Tel：（010）57833263， Email：cyzhu@impladaccn

[作者简介]何亚丽，硕士研究生，Email：heyalisky@126com菠萝叶提取物黏附漂浮微丸的

制备及评价