侵袭性真菌疫苗的免疫抑制造模及免疫指标研究

陈 勉，袁丹丹，牛林林，陈 磊，邵华荣，张晓元，张艳艳，刘 飞, ，凌沛学, ，陈 凯

（1. 山东省药学科学院 山东省生物药物重点实验室 山东省多糖类药物工程实验室 多糖类药物发酵与精制国家地方联合工程实验室 博士后科研工作站，山东 济南 250101；2. 山东大学药学院，山东 济南 250101；3. 东阿生力源阿胶股份有限公司 聊城市阿胶多肽提取技术研发重点实验室，山东 聊城 252218）

侵袭性曲霉病、侵袭性念珠菌病等侵袭性真菌感染发病率近年不断升高[1-4]，尽管检测水平不断提高，如某些常见致病真菌可通过分子技术平台实现特异快速检测，达到缩短诊断时间尽早用药目的[5]，但侵袭性真菌病的致死率仍然高达40 %。病例数呈指数级上升的金假丝酵母（Candida auris）侵袭性真菌病死亡率接近60 %[6-10]，部分罕见真菌赛多孢子菌（Scedosporium）、多育孢子虫（Lomentospora）可达80 %[11]。死亡率高的可能原因是侵袭性真菌病的病原体为条件致病菌，个体致病菌株的早期可检出性有不确定性，可选的治疗药物品种和策略有限[12]，也与耐药株出现及侵袭性真菌病患者自身免疫抑制状态等有关。

目前临床抗真菌的药物主要是唑类、两性霉素、棘白菌素等直接抑杀体内真菌的化学药物，不能有效防控临床侵袭性真菌病[13]。Ademe等[14]认为在目前的治疗策略中，免疫调节和干预是近年抗侵袭性真菌病研究的重要研究方向，尤其是预防侵袭性真菌病疫苗研究[15]。随着对真菌感染和机体应答机制的认识逐步深入，Boniche等[16]报道了动物实验有效的候选疫苗临床前研究。但自10年前首次开展2 ～3种抗真菌疫苗（非侵袭性真菌病）的I期、II期临床研究[17-18]，至今仍没有治疗或预防侵袭性真菌感染的疫苗获批，该方向疫苗缺乏是一个日益重要的问题[19-20]。因此，为提高临床实验成功率，仍需进一步加强临床前的预防侵袭性真菌病疫苗筛选和优化研究。

用于抗真菌感染的实验动物模型有小鼠、果蝇、线虫、鹌鹑蛋[21-22]等类型，但涉及免疫保护应答和真菌挑战测试的主要是通过小鼠进行研究，这些哺乳动物模型更能代表人类的情况。目前预防真菌感染的模型研究，主要采用常规体液免疫和攻毒致死率、肾脏菌载量和肾脏PAS染色切片[21,23]等指标，还需不断探索模拟临床患者状况的免疫抑制造模方法，建立和选择具有针对性的免疫功能和信号通路分析指标，这对加快疫苗开发具有重要指导意义。

1 免疫抑制造模方法

包括真菌在内的环境微生物与人体皮肤黏膜屏障、固有免疫和适应性免疫系统相互影响和作用，当人体免疫平衡被破坏后，会显现疾病状态。临床发生侵袭性真菌病病因主要有医源性治疗和自身免疫低下，包括化疗药物、免疫抑制剂、广谱抗生素、假体装置和移植，中性粒细胞减少症和人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV），导致在健康人群体内共生的部分真菌侵袭发病[24]。前期的侵袭性真菌病的临床前免疫治疗实验若在健康小鼠上进行，在功效分析时，小鼠正常的免疫功能可能被忽视，得到的部分治疗有效结论的证据可能不充分，所以有必要首先研究建立免疫功能受到抑制的小鼠模型。

1.1 药物诱发的免疫抑制

Xin[25-26]研究在接种白假丝酵母菌前3天，对小鼠腹腔注射200 mg/kg环磷酰胺；在给予真菌感染后每10天（或7天）按150 mg/kg连续注射，使首次注射后3 ～4天中性粒细胞<500 个/mm3，并持续整个实验期间。Moser等[27]研究发现，对小鼠单次环磷酰胺200 mg/kg腹腔注射后，外周血白细胞迅速被抑制，虽然多形核白细胞和单核细胞数量迅速反弹回正常和更高水平，而淋巴细胞在4周观察期内能保持被抑制状态。Zhang等[28]按 80 mg/kg剂量给小鼠腹腔注射环磷酰胺，注射后第3，4天体重明显下降，第10天检测结果显示胸腺和脾脏指数明显下降，巨噬细胞吞噬作用降低，干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）和白介素10（interleukin-10 kt,IL-10）水平升高，免疫球蛋白G（immunoglobulin G, IgG）、IgM和IgA数量减少。Singh等[29]在最后一次增强免疫后的第12天，也是真菌攻毒日的倒数第2天和攻毒后第3天，小鼠腹腔注射200 mg/kg环磷酰胺和皮下注射250 mg/kg醋酸可的松，使小鼠中性粒细胞减少。还有文献报道单独使用皮质类固醇建立小鼠免疫抑制模型[30]，及从真菌攻毒日的倒数第3天直到实验结束，每天给小鼠125 mg/kg剂量皮下注射醋酸可的松模型[25]。Wiederhold[31]在真菌感染小鼠前1天，一次性按150 mg/kg给予氟尿嘧啶，感染后第1 ～8天小鼠血液中的中性粒细胞数量<2×109个/L（最低1×109个/L）。

1.2 骨髓移植形成的免疫抑制

小鼠在骨髓移植后约3天在外周血和肺部可观察到严重的中性粒细胞减少，由此可制作小鼠免疫力低下模型[32]。首先将C3H/HeJ小鼠暴露于18 mV光子束直线加速器的9 Gy单次致死剂量下，设置焦点到皮肤的距离为75 cm，剂量为0.7 Gy/min，造成骨髓抑制；然后将从DBA/2小鼠股骨和胫骨取出的骨髓，去除T细胞后，制成4×106细胞/ml悬液通过C3H/HeJ小鼠尾静脉注射0.5 ml进行骨髓移植。

1.3 转基因小鼠免疫抑制

Yu等[33]报道Harlan公司的Beigenu/nuXIDIII是免疫抑制裸鼠，可直接用于研究。一种具有补体途径C5遗传缺陷的近交系A/J小鼠，不需环磷酰胺诱导免疫抑制，有望成为研究金耳酵母侵袭性感染发病机制的模型，用于由真菌引起的免疫反应和筛选抗真菌疫苗研究[34]。

2 免疫功能指标

传统减毒株方法制备的疫苗可能不适用免疫抑制患者，Oliveira等[18]认为开发亚单位等类型疫苗有望提高免疫抑制患者的应用安全性，但这类探索性疫苗的有效性研究需对疫苗免疫应答机制和功能有更深入认识。

2.1 细胞免疫功能

入侵机体内环境的真菌抗原通过抗原呈递细胞（antigen-presenting cell, APC）主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）II类分子递呈给CD4+T辅助细胞（Th）。CD4+Th介导释放免疫细胞因子、帮助B细胞和CD8+T细胞发挥作用，对于防御真菌病至关重要。CD4+Th细胞可进一步诱导分化为辅助型T细胞（Th1、Th17、Th2）和调节性T细胞（Tregs）。Th1、Th17细胞有促进炎症反应作用，其中Th1细胞所释放的IFN-γ和Th17细胞所释放的IL-17在对抗真菌作用中起到关键作用；Th2细胞辅助B细胞活化发挥体液免疫的作用，也可加剧感染程度促进过敏反应造成宿主组织损害；Tregs是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，可调节机体免疫功能，协调对机体的保护/损害两类免疫作用。Tregs的双向调节功能也造成人体对真菌的耐受和长期感染，并且有研究显示人体抗真菌功能的发挥并不依赖Tregs，因此本文对Tregs的功能考察从略[35]。综上所述目前预防侵袭性真菌感染疫苗研究的关键技术是如何激发强烈的T细胞免疫应答。

分析具有特定表面标志性分子T细胞及相应细胞因子的水平及变化是监测候选疫苗诱导T细胞免疫应答的重要工具，可通过酶联免疫斑点技术（enzyme linked immunospot assay，ELISpot）或酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）以及流式细胞胞内因子染色法（intracellular cytokine staining，ICS）实现[29,36-37]。目前在预防侵袭性真菌感染疫苗研究中，常见的T细胞亚型及所分泌的细胞因子种类见表1。

表1 考察候选疫苗对T细胞亚群作用机制的表面标志性分子和细胞因子

2.2 固有免疫吞噬功能

Ravikumar等[24]指出在机体的抗真菌过程中，巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞等固有免疫系统的病原体识别受体（pathogenrecognition receptor，PRR）首先识别真菌细胞壁中葡聚糖、几丁质、甘露聚糖等病原体相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP），具有募集和发挥吞噬、定向杀灭真菌病原体，及分泌细胞因子介导炎症反应和进行抗原递呈等重要作用；同时发现巨噬细胞的抗真菌活性可被粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、IFN等细胞因子刺激而增强。Lionakis等[35]发现在侵袭性真菌感染过程中，巨噬细胞等吞噬细胞可通过表观遗传重组引起组蛋白三甲基化和乙酰化，产生属于固有免疫具有记忆功能的驯化免疫。

2.2.1 巨噬细胞活性 巨噬细胞通过PAMP识别入侵真菌，主要发挥吞噬和胞内杀灭真菌作用。Singh等[29]采用调理吞噬细胞杀灭试验法（opsonophagocytic killing assay，OPK），培养小鼠RAW264.7巨噬细胞，添加1 ng/ml 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）处理24 h激活巨噬细胞；将活化的巨噬细胞与金耳酵母细胞以1:1比例添加至微量滴度孔，温和摇动培养2 h定量接种于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）琼脂平板，通过平均菌落数计算巨噬细胞对金耳酵母细胞的杀灭率。Wüthrich等[37]从小鼠肺泡灌洗液收集巨噬细胞，以105个细胞/孔的浓度于37 °C，5 % CO2培养3 h，洗去未贴壁的细胞，在完全培养基或添加IFN-γ、IL-17A/A和IL-17 A/F的培养基中过夜；添加感染指数达到0.01的皮炎杆菌酵母，于37 °C，5 % CO2共培养24 h，收集上清，并用无菌水溶解细胞。将裂解液涂布于脑心浸液琼脂上，1周后计数菌落数。

2.2.2 中性粒细胞活性 中性粒细胞是固有免疫的主要效应细胞，可通过Toll样受体2（Toll like receptor 2, TLR2）、TLR4、C型凝集素受体（C-type lectin receptor, CLR）、dectin-1、穿透素3（pentraxin3,PTX3）和补体受体识别真菌，释放中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil Extracellular Traps, NET ）、细胞因子或作为调理素，高效、快速杀灭真菌。在真菌感染中，炎症部位的中性粒细胞募集、活化和存活受Th17通路的影响[24]。收集小鼠腹膜中的中性粒细胞，按4×105个细胞/孔的浓度培养2 h后收集非黏附细胞；在完全培养基或添加刺激液的培养基中培养过夜；添加测试用真菌，于37 °C，5 % CO2共培养4 h，收集上清并溶解细胞，涂布于脑心浸液琼脂上培养计算真菌菌落数[37]。中性粒细胞对体内不同真菌的杀伤能力有差异，如与白色念珠菌相比，人类中性粒细胞不能有效地杀死金耳酵母[40]。有发现脾脏酪氨酸激酶是中性粒细胞对念珠菌不同种反应的重要调节因子[41]。

2.2.3 树突状细胞活性 树突状细胞通过dectin-1、TLR2和TLR4等受体识别真菌，释放细胞因子激活固有免疫，通过抗原递呈促进原始T细胞向CD4+T细胞的分化[24]。

树突状细胞吞噬作用试验，是将树突状细胞接种于96孔板，然后将荧光标记的白色念珠菌以树突状细胞:酵母 = 1:1的比例与树突状细胞混合；培养一段时间后加入台盼蓝猝灭未被树突状细胞吞噬的白色念珠菌荧光。收集细胞并通过流式细胞术和荧光显微镜分析被吞噬的白色念珠菌[42]。树突状细胞杀伤试验，是将树突状细胞接种后，加入50 μl 2×106ml/L白色念珠菌至第一个树突状细胞孔中混合，然后以1:4比例连续稀释白色念珠菌6次分别与其余树突状细胞混合；同时将不与树突状细胞混合培养的白色念珠菌以平行方式稀释作为对照组；培养24 h后通过显微镜计算每个孔中的白色念珠菌菌落数，白色念珠菌菌株的存活率=含树突状的菌落数/无树突状细胞的菌落数×100%[42]。

除此之外，有抗真菌作用的固有免疫细胞还有分泌GM-CSF的自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）细胞、介导IFN-γ依赖性杀伤的 γδT细胞、上皮细胞和内皮细胞[35,43]。

2.3 体液免疫功能

在Th2细胞IL-4、IL-10和IL-13等细胞因子作用下，B细胞可被活化形成浆细胞，生成和分泌大量特异性抗体，通过ELISA反应检测抗体滴度进行研究[29]。但是真菌受宿主抗体介导的消除效果通常不及细菌，例如通过识别抗原抗体复合体Fc端信号补体可裂解消杀细菌，而真菌能抵抗这种裂解作用[44]。

3 免疫信号通路指标

抗真菌的免疫应答过程，通过宿主的模式识别受体PRRs介导激发下游信号通路，促进响应细胞因子释放，激活吞噬、杀灭真菌等固有免疫反应，及通过抗原递呈形成适应性免疫直接或间接调节T淋巴细胞的功能[45-49]。已知能识别真菌的PRR数量远多于其他微生物的[50]。识别真菌的PRR的指标性受体按重要性主要有CLR、TLR和其他型。真菌表面不同多糖的疫苗相关PRR包括识别β-葡聚糖的CLR如dectin-1，TLR如TLR-2；识别甘露糖的Dectin-2/dectin-3、甘露糖受体（mannose receptor，MR）、巨噬细胞诱导的C型凝集素受体（macrophage-inducible C-type lectin，Mincle）、galectin-3、树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子（DC-specific intercellular adhension molecular-3 grabbing nonintigrin，DCSIGN）和TLR的TLR-2/TLR-4；识别几丁质的MR，TLR-9和其他类的NOD样受体（nucleotide binding oligomerization domain like receptors 2，NOD-2）[50]。

近年新发现的潜在靶标，如c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase 1, JNK1）通过抑制CD23表达下调宿主抗真菌的固有免疫反应，有望作为抗真菌感染的治疗性靶标[51]。shCD5受真菌β-葡聚糖激活，可提高攻毒小鼠存活率，减少真菌负荷和增加靶器官白细胞浸润[52]。E3泛素连接酶CBL-B有重要调节作用，通过CBL-B可调节巨噬细胞和树突状细胞的CLR信号通路，抑制CBL-B通路可增加杀伤真菌作用[53]。B细胞表面信号CD23（CLEC4）是真菌的CLR，可识别白念和曲霉细胞壁的α-甘露糖和β-葡聚糖，但不能识别隐球菌，可与FcRr形成复合物诱导NF-κB活化，产生抗真菌的免疫作用[54]。

总之，随着预防侵袭性真菌感染的疫苗研究深入，更多的影响因素和隐藏的机制正在被发现，与防治效果关联性更明显的指标逐步明朗，可用的实验动物模型和攻毒真菌种类[55]也不断得到丰富，这些将有助于尽早快速准确筛选出适合人类预防侵袭性真菌感染的疫苗。