精子密度对杂交黄颡鱼“黄优1号”受精率、孵化率及出苗率的影响

程景颢，李 杰，付东勇，储明旭，张 凯，王 涛，尹绍武，唐忠林，茆健强，周国勤

（1.南京师范大学海洋科学与工程学院，江苏省特色水产育种与绿色高效养殖技术工程研究中心，南京 210023；2.南京市水产科学研究所，南京 210029）

黄颡鱼（Pelteobagrusfulvidraco）别名黄辣丁、黄姑子、黄沙古、昂刺鱼等，隶属于鲇形目（Siluriformes），鲿科（Bagridae），黄颡鱼属，在我国广泛分布于长江、黄河、珠江及黑龙江等各水系［1］。黄颡鱼属鱼类种类较多，目前我国已报道的有5种，分别为黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼（P.vachelli）、长须黄颡鱼（P.eupogon）、中间黄颡鱼（P.intermedius）和光泽黄颡鱼（P.nitidus）［2］。本研究所选的杂交黄颡鱼“黄优1号”是以二代选育的瓦氏黄颡鱼为父本，三代选育的黄颡鱼为母本，所获得的杂交子代。其生长速度和成活率均高于母本黄颡鱼，抗病性强；与父本瓦氏黄颡鱼相比，可食用部分多，营养丰富，更耐运输，深受广大养殖户和消费者的欢迎，目前已成为我国重要的优质水产养殖品种［3］。

人工授精是鱼类人工繁殖的重要环节，高质量的精子是保证授精成功的重要因素之一。精子密度是评价精子质量的重要指标，不仅可以用来判断精液质量的好坏，还直接关系到人工授精的效果。在授精过程中，精子密度过低会降低受精率，过高则会引起多精入卵，导致胚胎发育后期畸形率增加。因此，鱼类人工授精时采用适宜的精子密度是提高受精率与孵化率的关键［4］。目前，国内外关于鱼类精子密度对人工授精效果影 响 的 报 道 较 多，如 黄 颡 鱼［5］、虹 鳟（Oncorhynchusmykiss）［6］、美 洲 拟 鲽（Pseudopleuronectesamericanus）［7］、斑 点 叉 尾 鮰（Ictaluruspunctatus）［8］等。迄今为止，针对杂交黄颡鱼的研究主要集中在雌雄差异判别［9］、核型分析［10］、分子标记［11］和精子冷冻保存［12］等方面，而关于精子密度对杂交黄颡鱼授精结果影响的研究尚未见报道。

目前，我国杂交黄颡鱼已经开展规模化人工繁育，但在人工繁殖过程中，由于雌、雄鱼发情期不同步且需要杀死父本以获取精子，从而导致雄鱼使用率和子代受精率低［13］。此外，由于瓦氏黄颡鱼的市场效益不高，其养殖产量较低，加上近年来过度捕捞，导致瓦氏黄颡鱼野生资源日益减少。作为杂交黄颡鱼的父本，瓦氏黄颡鱼种质资源的衰退对杂交黄颡鱼的规模化制种造成了不利影响。因此，确定杂交黄颡鱼人工授精的最佳精子密度，将有利于提高瓦氏黄颡鱼精子利用率、减少雄鱼宰杀量和优化冷冻保存精子的条件。本研究采用8组不同精子密度对杂交黄颡鱼开展人工授精实验，并对所得实验数据进行统计分析和比较，旨在筛选出最适宜的杂交黄颡鱼人工授精精子密度，为杂交黄颡鱼规模化高效制种提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 亲鱼的选择

杂交黄颡鱼亲本均为江苏省南京市水产科学研究所禄口基地自行培育，雄鱼瓦氏黄颡鱼规格（300±20）g，雌鱼黄颡鱼规格（150±30）g，亲鱼体质健壮、无伤无病，性腺发育情况良好。

1.2 精子保存液的制备

本实验所采用的精子保存液为黄颡鱼精子保存专用液［14］，配方如下：NaCl 7.68 g、KCl 0.22 g、NaHCO30.25 g、Na2CO30.21 g、葡萄糖2.0 g、蒸馏水1 L。

1.3 催产药物及用具

催产药物选用宁波三生生物科技有限公司生产的促黄体素释放激素A2（LHRH-A2）、绒促性素（HCG）、马来酸地欧酮（DOM），开展人工授精实验时用配制好的保存液对精液进行稀释。

实验器具：5 mL连续注射器、1.5 mL离心管、移液枪、培养皿、奥林巴斯显微镜、血球计数板等。

1.4 孵化室及孵化条件

实验于2020年7月在南京市水产科学研究所禄口基地进行，该基地配备有齐全的设施、专业的实验室和孵化室。孵化室内有72个长0.8 m、宽0.5 m的长方形孵化池，并配有完善的充氧设备，每平方米放一个气石，保证池水中的氧气供应充足；另设有专用的流水孵化箱，水源为深井水，理化条件稳定，pH值7.5～8.0。水源经过晾晒曝气后加入到孵化池，水温为（27±1）℃。

1.5 实验方法

1.5.1 实验设计

根据前期的预实验结果，初步优化了精卵比例（1粒卵子对应的精子数量，即精子密度），本研究一共设置8个密度梯度：1.0×103、5.0×103、1.0×104、2.5×104、5.0×104、1.0×105、5.0×105、1.0×106个·mL－1，每个梯度设3个重复。每个梯度卵子数量固定为200粒，根据卵子数将每个密度梯度对应数量的精子事先转入到1.5 mL离心管中，并加入0.9%生理盐水定容至1 mL。

1.5.2 精液采集与计数

实验用鱼亲本捕捞后暂养在水泥池，精液收集采用杀鱼取精的办法。采集精子时剖开雄鱼腹腔，用镊子取出精巢，挑出血丝，在干净的培养皿中剪碎，用80目的聚乙烯绢布过滤，并用保存液冲洗绢布，将过滤后的精液收集到精子保存液中。

用移液枪取上述精液25μL置于血球细胞计数板，盖上盖玻片置于显微镜下计数。精子计数的结果为：计数板上半部和下半部计数室中个数的平均值×稀释倍数［15］，重复计数3次，取其平均值。经计算，瓦氏黄颡鱼新鲜精液的精子密度为（1.625±0.589）×1011个·mL－1。经镜检，精子活力均在95%以上。

1.5.3 卵子采集

在人工授精前24 h对雌鱼注射渔用HCG、LHRH-A2和DOM混合药物，以促使其卵子成熟。雌鱼取卵时，左手抓住黄颡鱼，鱼头向内、鱼腹向上，用右手大拇指用力挤压雌鱼的腹部，避免鱼卵与水接触［16］。卵子收集后对其活力进行评估，CHATAKONDI和TORRANS［17］认为卵液的pH值与其质量正相关，卵液的pH＞7.4即可以判断卵子质量合格，经测定实验卵液pH为7.8。

1.5.4 人工授精及孵化

首先将裁剪好的网片平铺于纸杯底部，纸杯内衬薄层为植物油脂提取物。实验前统计黄颡鱼卵子密度为（400±15）粒·g－1，在每个网片上加入0.5 g的卵液；之后将每个密度梯度对应的精子数量用移液枪加入到卵子上面，并轻轻摇晃杯底5 s；然后每个网片加入5 mL的曝气水（27.5～28.5℃），轻轻摇晃杯底2 min使其充分受精；将网片转移到孵化池中进行后续孵化。

孵化方式采用流水孵化，本实验孵化用水符合《中华人民共和国国家标准：渔业水质标准（GB11607-1989）》的规定［18］。受精卵孵化至原肠晚期时，未受精的卵可通过其颜色发白、不透明的特征进行肉眼辨认，并及时剔除，避免真菌和细菌的感染。此时计数受精卵数，然后继续孵化，鱼苗出膜后计数出膜鱼苗数，之后，等待出膜鱼苗发育至平游期开口摄食，计数开口摄食鱼苗数，每个梯度测算的3个样取其平均数，计算公式如下：

1.6 数据统计分析

各组实验均重复3次，实验数据用“平均数±标准差（±SD）”表示。使用Excel 2019和SPSS 24.0软件对数据进行统计分析，分别用方差 分 析（ANOVA）、LSD（least significant difference）多重比较和Duncan法检验显著性差异。

2 结果与分析

2.1 瓦氏黄颡鱼精子密度与杂交黄颡鱼“黄优1号”受精率的关系

在受精卵处于原肠中期时观察并记数，统计受精率。受精率随着精子密度的增高呈现先显著上升后略有下降的趋势；当精子密度从1.0×103个·mL－1提高到2.5×104个·mL－1时，受精率显著上升（P＜0.05）；当精子密度为5.0×104时，受精率达到最大值为88.8%；此后，受精率开始下降，但各组之间差异并不显著（P＞0.05）（图1）。对8组不同浓度的精子密度与其相应的受精率采用线性函数、对数函数、指数函数、二项式函数和幂函数5种方程进行拟合，并回归分析，以相关性（R2）最紧密的作为选取型式。结果发现，二项式函数拟合效果最好：Y＝－2.26X2＋27.29X＋5.49（R2＝0.90）。其中，X代表精子密度，Y代表受精率（图2）。

图1 瓦氏黄颡鱼精子密度对杂交黄颡鱼“黄优1号”受精率的影响Fig.1 Effect of sperm density of P.vachelli on fertilization rate of hybrid yellow catfish“Huangyou-1”

图2 瓦氏黄颡鱼精子密度与杂交黄颡鱼“黄优1号”受精率回归曲线Fig.2 Regression curve between sperm density of P.vachelli and fertilization rate of hybrid yellow catfish“Huangyou-1”

综上可知，精子密度的高低直接影响到杂交黄颡鱼的受精率：当精子密度过低时，受精率也往往偏低；精子密度过高时，受精率并不会随之一直升高，还造成了雄鱼配子资源的浪费。当精子密度在2.5×104～1.0×105个·mL－1范围内时，受精率最理想。

2.2 瓦氏黄颡鱼精子密度与杂交黄颡鱼“黄优1号”孵化率的关系

当精子密度从1.0×103个·mL－1提高到2.5×104个·mL－1时，孵化率显著上升（P＜0.05），从35.3%提高到83.4%，并在精子密度为2.5×104个·mL－1时达到最大值；而当精子密度从2.5×104个·mL－1提高到1.0×106个·mL－1时，孵化率则随之下降，在精子密度为1.0×106个·mL－1时，孵化率仅为68.1%（图3）。由于数据的非线性，采用曲线回归分析精子密度与孵化率的关系，其中二项式函数拟合效果最好，其方程为：Y＝－2.42X2＋26.73X＋7.90（R2＝0.91）。其中，X代表精子密度，Y代表孵化率（图4）。

图3 瓦氏黄颡鱼精子密度对杂交黄颡鱼“黄优1号”孵化率的影响Fig.3 Effect of sperm density of P.vachelli on hatching rate of hybrid yellow catfish“Huangyou-1”

图4 瓦氏黄颡鱼精子密度与杂交黄颡鱼“黄优1号”孵化率回归曲线Fig.4 Regression curve between sperm density of P.vachelli and hatching rate of hybrid yellow catfish“Huangyou-1”

综上可知，精子密度的大小直接影响到孵化率的高低，但精子密度过高和过低均不能使孵化率达到最大值。当精子密度在2.5×104～5.0×104个·mL－1范围内时，孵化率最高。

2.3 瓦氏黄颡鱼精子密度与杂交黄颡鱼“黄优1号”出苗率的关系

由图5可见，当精子密度从5.0×103个·mL－1提高到2.5×104个·mL－1，出苗率显著上升（P＜0.05），并在精子密度为2.5×104个·mL－1时，出苗率达到最大值（79.4%）。当精子密度继续提高，出苗率不再增加。对数据进行回归分析，发现二项式R2值最高，拟合效果最好，其方程为：Y＝－1.92X2＋22.18X＋9.42（R2＝0.79）。其中，X代表精子密度，Y代表出苗率（图6）。当精子密度在2.5×104～1.0×105范围内时，出苗率最高。

图5 瓦氏黄颡鱼精子密度对杂交黄颡鱼“黄优1号”出苗率的影响Fig.5 Effect of sperm density of P.vachelli on emergence rate of hybrid yellow catfish“Huangyou-1”

图6 瓦氏黄颡鱼精子密度与杂交黄颡鱼“黄优1号”出苗率回归曲线Fig.6 Regression curve between sperm density of P.vachelli and emergence rate of hybrid yellow catfish“Huangyou-1”

3 讨论

在水产动物人工授精时，受精率受到精子密度、卵子质量、授精技术及繁殖环境等各种因素的影响，但最适宜的精子密度仍是提高受精卵受精率与孵化率的关键［19］。BUTTS等［7］认为，当精子密度为3.4×104个·mL－1时，美洲拟鲽卵子的受精率达81.3%；高绪生等［20］在对皱纹盘鲍（Haliotisdiscushannai）的研究中发现，精子密度在1×105～1×106个·mL－1范围内时，受精率随精子密度的增加而提高；SUQUET等［21］认为，精子密度为6×103个·mL－1时，大菱鲆（Scophthalmusmaximus）的孵化率最高；隋锡林等［22］在对刺参（Stichopusjaponicus）的研究中发现，当精子密度为2×105个·mL－1时，受精率接近100%；BUTTS等［23］研究精子密度对鳕（Gadus morhua）受精的影响时发现，当精子密度为1×105个·mL－1时，其受精率和孵化率达到最大；BART和DUNHAM［8］发现，在斑点叉尾鮰人工授精过程中，当一个卵子周围的精子数量低于5×104个时，会导致受精成功率显著降低；IANAE等［24］发现，当精子密度为1×106个·mL－1时，欧洲鳗（Anguillajaponica）的受精率达到最大；LINHART等［25］对鲤（Cyprinuscarpio）的研究发现，当一个卵子周围精子数量超过2.4×105个时，其受精率将不再增加。由此可知，精子密度对受精率和孵化率均具有重要影响。

本实验中，当精子密度在2.5×104～1.0×105个·mL－1范围内时，受精率最高（可达88.8%）；当精子密度在2.5×104～5.0×104个·mL－1范围内时，孵化率最高（可达83.4%）；当精子密度在2.5×104～1.0×105个·mL－1范围内时，出苗率最高（可达79.4%）。由此可见，在杂交黄颡鱼实际生产过程中，父本瓦氏黄颡鱼精子密度在2.5×104～5.0×104个·mL－1范围内时，可实现生产效率和经济效益的最大化。ZHANG等［5］对黄颡鱼研究发现，当精卵比为3×104∶1时，黄颡鱼受精率最高为84.1%，本实验结果与其大致吻合。此外，鲁大椿等［26］认为，鱼类人工授精适宜采用的精卵比为（3～4）×105∶1，这一结果表明，不同鱼类授精的最适精子密度存在差异，在杂交黄颡鱼繁殖生产中，可以使用相对较低的精子密度来提高生产效率，从而节约雄鱼亲本资源，降低生产成本。

成熟的瓦氏黄颡鱼精巢呈现栉状分支，每一分支的内部结构呈树叶型，而精巢小叶又由许多壶腹状的精小囊组成。成熟的黄颡鱼卵呈圆形，且卵子表面仅有1个受精孔，卵膜上有以受精孔为中心分布的辐射状沟嵴，卵径为1.0～1.2 mm［27－28］。对于淡水物种，精子自激活后的活跃时间通常只有不到1 min［29］。黄颡鱼授精时受精孔区会出现环状隆起，起到一个缓冲作用，只允许少数活性高的精子越过隆起进入精孔管，而大多数活力弱的精子则被阻挡在外面，从而保证授精的质量［30］。本实验发现，精子密度为1×103个·mL－1时，杂交黄颡鱼的受精率、孵化率和出苗率均偏低，而随着精子数量的增加，其受精率、孵化率和出苗率均相应的提高。在杂交黄颡鱼人工授精过程中，当精子密度过低时，活力高的精子穿过卵膜孔进入精孔管的几率更小，导致较低的受精率和孵化率；而随着精子密度的提高，活力高的精子进入精孔管的几率也大大增加，从而导致受精率的提高。另外，在实验中还发现，当精子密度超过一定的阈值，精子数量增加将不再导致生殖力的提高。具体来讲，当精子密度超过5.0×104个·mL－1时，受精率将不再提高（图1）；当精子密度超过2.5×104个·mL－1时，孵化率和出苗率均开始下降（图3，图5）。这与对斑点叉尾鮰的研究结果相类似［31］。这可能是由于其受精方式为单精入卵，当精子密度达到一定阈值后，随着精子密度的提高，活力高的精子进入精孔管的优势不再明显增加。ROSENTHAL等［32］认为，受精卵在卵裂、受精及孵化变态过程中耗氧量激增，且精子密度的增加会造成局部溶氧不足，引起孵化水的腐败，从而影响卵的正常受精与孵化。

本实验设置8组不同的精子密度（1.0×103～1.0×106个·mL－1）对杂交黄颡鱼进行人工授精，并确定了最佳授精精子密度。建议实际生产中宜采用2.5×104～5.0×104个·mL－1的精子密度范围进行人工授精，该密度使用的精子数量比之前实际生产中使用的要少，可以有效节约雄鱼配子资源，减少人工制种过程中对冷冻保存精子的需求。本实验筛选出的最适精子密度可作为杂交黄颡鱼规模化生产中的最优选择，也可为黄颡鱼属鱼类人工授精和杂交育种提供一定的参考和借鉴。