驯鹿精子显微与超微结构研究

邢海华，刘伟石，左 月，郑 义，李和平

（东北林业大学 野生动物与自然保护地学院，哈尔滨 150040）

精子属于生殖细胞，由雄性动物产生并能将遗传物质稳定地传递给子代，当动物精子的生理结构与功能出现异常时，会影响雄性动物的繁殖能力，甚至会影响子代的健康状况。因此，对精子的形态特征以及超微结构进行细致的研究，能够进一步检验不同处理方法对精子结构的影响，还能为精子的体外受精、顶体反应发生时精子结构的改变情况提供基础数据，即精子形态以及结构的研究能够有助于受精规律的揭示与总结［1］。而对动物精子超微结构的研究经过了一个漫长的探究过程，最初有学者对人、狗的精子进行超微结构研究；随着电镜技术的不断升级与改造，动物精子超微结构研究方式也产生了质的飞跃。国内对哺乳动物精子超微结构的探究相对较晚，曾陆续对绵羊［2］、驴［3］、猪［4－6］、兔［7］、大熊猫［8］、蓝狐［9－10］、梅花鹿［11－12］等动物精子的超微结构展开了细致的研究，并详尽分析了顶体囊泡化的特征以及各类动物精子的结构特异性。

关于鹿精子超微结构的研究也已有一些基础，如冯怀亮等［11］通过电子显微镜对东北梅花鹿精子的超微结构进行细致观察，结果表明，东北梅花鹿精子的超微结构与其他哺乳动物精子相差不大，最明显特征是其精子顶体前端相对膨大，头部偏长，有明显的环状结构将精子的中段与主段分开。杨智等［12］通过光学显微镜以及电子显微镜观察了梅花鹿精子在冷冻前后超微结构的改变，结果表明，冷冻解冻后精子顶体部位发生膨胀，部分精子的顶体内容物外溢，顶体内部出现明显空泡现象，部分线粒体丢失。之后，李和平等［13］对马鹿精子的超微结构进行了观察与研究，并成功测得马鹿精子的全长以及头、颈、尾长。史文清等［14］观察并对比分析了冷冻保存方法对马鹿精子超微结构的影响与作用。

驯鹿是我国使鹿部落鄂温克少数民族的重要生产资料，仅分布于北纬50°～53°的我国内蒙古大兴安岭根河市，由二十几个鄂温克家庭饲养，数量约有1 000头。关于我国驯鹿精子形态以及超微结构的研究尚未见报道。试验对驯鹿精子形态结构及超微结构进行观察，并对其结构的各部分进行观测，掌握驯鹿精子的显微与超微结构，以期为驯鹿精子精液冷冻保存、体外受精与顶体反应发生过程等研究提供基础数据与技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

驯鹿精液，于2020年9月采自根河林业局驯鹿养殖基地的3头成年健康驯鹿，制成细管冻精，用38～40℃水浴解冻，解冻后精子活力在0.3以上，用0.1 mol／L磷酸盐缓冲液（PBS溶液，pH值7.2）冲洗2次，每次6 000 r／min离心2 min，除去上清液，将最后一次沉淀加入0.1 mol／L PBS溶液1 mL，以保持驯鹿精子活力及形态结构。

1.2 主要器械、仪器与化学试剂

TDL－5－A低速台式大容量离心机，购自上海安亭科学仪器厂；OLYMPUS IMF－2相差显微镜，购自日本OLYMPUS株式会社；MOTIC SFC－18 SERIES油镜，购自麦克奥迪实业集团公司；量制沪字02270113血细胞计数板，购自上海市求精生化试剂仪器有限公司。以上仪器由东北林业大学野生动物与自然保护地学院公共实验室提供。

H－7650透射电子显微镜，购自日本日立公司；EM UC7超薄切片机，购自德国LEICA公司。以上仪器由东北农业大学分析测试共享中心提供。

PBS、戊二醛、吉姆萨染色液、四氧化锇溶液、乙醇、丙酮、环氧树脂812包埋剂、醋酸双氧铀和柠檬酸铅，由东北农业大学分析测试共享中心提供。

1.3 显微镜检

通过光学显微镜对驯鹿精子进行镜检观察，研究其显微结构特征。

1.3.1 染色 用0.1 mol／L PBS溶液（pH值7.2）冲洗3次，并将精子稀释成1×104个／mL，涂抹在载玻片上，空气干燥。用吉姆萨染色液滴在涂片上染色5 min，再用纯化水冲洗，待干燥。

1.3.2 镜检 将样品放置在显微镜下观察结构特征。

将目微尺放入目镜，测量精子长度，在不同放大倍数下用台微尺校正测微尺。需要注意的是，如果调整显微镜的放大倍数，则需要重新用台微尺校正测微尺。

在视野中任选45个精子，测量精子的全长以及头部、颈部、尾部各部分长度，各部分测量不少于3次，取平均值，并记录，之后用SPSS软件进行统计分析。

1.4 精子超微结构研究

利用透射电子显微镜技术研究驯鹿精子超微结构。

1.4.1 前固定 将精子悬液用0.1 mol／L PBS溶液（pH值7.2）冲洗3次，每次10 000 r／min离心5 min，除去上清液；将最后一次沉淀加入2.5%戊二醛，预固定2 h，保持驯鹿精子形态结构。

1.4.2 冲洗 用0.1 mol／L PBS溶液（pH值7.2）冲洗3次，每次放入4℃冰箱中静置15 min，10 000 r／min离心3 min，去除上清液。

1.4.3 后固定 在通风橱内，滴加1%四氧化锇溶液，4℃冰箱内固定2 h。

1.4.4 冲洗 用0.1 mol／L PBS溶液（pH值7.2）冲洗3次，每次放入4℃冰箱中静置15 min，10 000 r／min离心3 min，去除上清液。

1.4.5 脱水 分别用50%、70%、90%乙醇进行梯度脱水，于4 ℃冰箱中静置5 min；期间10 000 r／min离心3 min，去除上清液，用100%乙醇脱水2次，于4℃冰箱中静置7 min，期间10 000 r／min离心3 min，去除上清液。

1.4.6 置换 用丙酮置换一次：无水乙醇、丙酮体积比为1∶1，各滴加0.5 mL，4℃冰箱静置7 min，再10 000 r／min离心3 min，去除上清液；再滴加1 mL无水丙酮，室温静置5 min。

1.4.7 浸透与包埋 用环氧树脂812进行浸透，纯丙酮、环氧树脂812包埋（体积比为1∶1），25℃静置30 min；纯丙酮、环氧树脂812包埋（体积比为1∶2），25℃静置90 min；再以纯丙酮、环氧树脂812包埋（体积比为1∶3），开盖过夜。再用环氧树脂812进行包埋。

1.4.8 聚合 在恒温箱内60℃聚合3 d。

1.4.9 切片 用超薄切片机进行切片，厚度5～7μm，所有切好的切片用带有支持膜的样品载网捞起，切片放进培养皿。

1.4.10 染色 在25℃条件下，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅进行双重染色，然后用纯化水冲洗，待检。

1.4.11 镜检、照相 用H－7650透射电子显微镜对处理好的样品进行镜检，并照相记录。

2 结果

显微镜下观测，驯鹿精子全长（90.545±5.374）μm，由头部、颈部、尾部构成，这三部分长度分别为（13.009±1.095）μm、（1.991±0.694）μm、（75.545±5.592）μm。

2.1 头部

驯鹿精子头部呈现略微扁平的卵圆形，头长（13.009±1.095）μm，内部含有高度浓缩并且电子密度相对较高的精核，精核的矢状面呈现长楔形。顶体是两层膜结构，形似囊状，包裹在精核外侧，远离精核的一侧是顶体外膜，邻近精核的一侧是顶体内膜，两层膜相对平行，且都是双层膜结构，两者在顶体尾部交相融合成为一个整体。顶体前端相对膨大且呈现对称结构，其电子密度相对较低；顶体后端为顶体后区，电子密度更低，见图1、图2。

图1 驯鹿精子超微结构（20 000×）

图2 驯鹿精子头部超微结构（20 000×）

2.2 颈部

驯鹿精子的颈部位于头部与尾部之间，部位较短，并且不明显，从近端中心粒到远端中心粒这一部位为颈部，颈长为（1.991±0.694）μm。近端中心粒位于精核下面的浅窝中，呈现偏短的圆筒状，与精子尾部的纵轴多呈垂直关系，矢状面多呈圆形。有漏斗状结构包裹在颈部的外侧，漏斗状结构由9条纵向紧密排布的粗纤维构成，上部附着于精核的下端，下部附着于精子尾部的中段。

2.3 尾部

驯鹿精子尾部位于颈部后侧，尾长为（75.545±5.592）μm，可分为中段、主段、终段。中段的纵切面清晰可见，线粒体呈现念珠状分布于轴丝的外侧，构成线粒体鞘，见图3、图4；横切面上，由9对微管结构形成同心环结构，中心部位有一对中央微管，形成“9＋2”结构，而外侧还包裹着9束外致密纤维，共同组成“9＋9＋2”结构，再外层被线粒体鞘包被着，见图5、图6。中段的末端与主段的起始部位有一个明显的环状结构。主段是驯鹿精子尾部的主要部位，周围包被着纤维鞘。纤维鞘的末端与细胞膜紧密贴合，构成一层薄膜包裹着微束管，在向后延伸过程中，末端直径缓慢变小。尾部主段横切面可见“9＋2”结构。终段是精子尾部的末端，结构相对简单，只有“9＋2”结构以及最外层的细胞膜。

图3 驯鹿精子尾部斜切面结构（25 000×）

图4 驯鹿精子尾部纵切面结构（30 000×）

图5 驯鹿精子尾部中段横切面结构（40 000×）

图6 驯鹿精子尾部横切面结构（20 000×）

3 讨论与结论

为了探究与揭示哺乳动物精子的形态构造与超微结构特征，一些学者陆续进行了各类哺乳动物精子的相关试验研究，尽管各类哺乳动物正常精子的形态与结构存在着一定的差异，但是都具有部分相同的结构特点：精子总体能够分成头部、颈部以及尾部，而尾部又可细分为中段、主段以及终段。哺乳动物精子之间最主要的差别是头部形态，如牛、猪、马等动物精子头部呈现略微扁平的卵圆形；而虎、人精子头部则呈梨形。造成各类哺乳动物精子头部出现显著区别的原因是精核与顶体的形态结构存在差异。本试验结果表明，驯鹿精子具备哺乳动物精子的主要特征，即含有头部、颈部、尾部，且尾部能够清晰地分为中段、主段、终段。

驯鹿精子全长（90.545±5.374）μm，头部长（13.009±1.095）μm，颈部长（1.991±0.694）μm，尾部长（75.545±5.592）μm，其中尾部占精子全长的比例最大；而马鹿精子全长（58.75±2.35）μm，头部长（8.93±0.24）μm ，颈部长（1.00±0.16）μm，尾部长（48.18±1.18）μm［13］。驯鹿精子头部、颈部、尾部的长度分别占精子全长的14.37%、2.20%、83.43%；马鹿精子头部、颈部、尾部的长度分别占精子全长的15.20%、1.70%、82.01%；驯鹿精子长度是马鹿精子长度的1.54倍；精子形态上，驯鹿精子头部相对偏小而尾长，马鹿精子则头相对偏大而尾较短；驯鹿精子与马鹿精子在全长以及各部位长度、比例上的差异可能是种属间的差异所造成的。

驯鹿精子的顶体前端相对平滑、膨大且呈现对称结构。精子颈部位于头部与尾部之间，部位较短，并且不明显。精子尾部的中段与主段可见清晰的环状结构，中段纵切面可见线粒体呈念珠状，紧密分布于轴丝的两侧，构成线粒体鞘；而横切面则能清晰观察到轴丝具有“9＋9＋2”微管结构，这与马鹿、梅花鹿精子的轴丝结构一致［11－14］，与其他哺乳动物如大熊猫［8］等的精子结构一致，与火鸡［15］等鸟类精子的轴丝结构相似。通常认为，中央微管具有传导的作用与功能，外围的9对微管结构承担收缩调节的功能。

4 致谢

试验中样品采集得到根河县林业局杨建民，计划科王庆海、田晓瑞，多种经营科吴晓宇、盖广辉等同志，以及都慧中老师的大力支持，在此表示感谢！