长链非编码RNA MIAT在幽门螺杆菌感染胃溃疡中的表达和作用机制

严皓哲，王勇兴，贝 艺

(普陀医院 消化内科，浙江 舟山 316100)

胃溃疡可导致患者出现腹痛、反酸、嗳气、呕血、便血，甚至胃穿孔等严重并发症。部分患者由于胃溃疡迁延不愈，可进一步恶化为胃癌，严重威胁患者的生命健康安全[1]。针对胃溃疡的抗生素结合胃黏膜保护剂、抑酸药物等三联治疗方案取得了一定的治疗效果，但胃溃疡的发生率依然居高不下[2]。相较于miRNA等其他非编码RNA，长链非编码RNA的生物学作用复杂，具有调控多种基因和其他非编码RNA的转录，转录后修饰，蛋白翻译前、翻译后修饰，功能蛋白转运和定位等作用[3-4]。大量研究[5]发现，长链非编码RNA参与机体生长发育和多种疾病的发生，幽门螺杆菌感染是导致胃溃疡发生的重要因素。本研究探讨长链非编码RNA MIAT在幽门螺杆菌感染胃溃疡中的表达意义和作用机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 DMEM培养基、胎牛血清、磷酸盐缓冲液(PBS)、0.25%胰蛋白酶-DETA、青霉素-链霉素等均购自Hyclone公司，弯曲杆菌琼脂基础培养基、Trizol、Lipofectamine 3000购自Thermo公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR©Premix Ex TaqTMII购自TaKaRa公司，CCK-8细胞活力检测试剂盒、Annexin V-FITC/ PI流式凋亡试剂盒购自江苏凯基生物科技有限公司，IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA试剂盒购自R&D公司。CO2细胞培养箱购自冠森生物科技(上海)有限公司，倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司，紫外分光光度计购自梅特勒-托利多国际有限公司，实时荧光定量PCR仪购自Applied Biosystems公司，流式细胞仪购自BD公司。

1.2 一般资料 收集2016年1月—2018年12月普陀医院幽门螺杆菌感染的胃溃疡患者120例及经胃镜检查胃黏膜正常的患者100例。纳入标准：①胃溃疡患者经胃镜检查和胃黏膜病理诊断确诊为胃溃疡；②胃黏膜正常患者经胃黏膜病理检查诊断胃黏膜正常。排除标准：①存在胃炎、胃间质瘤、胃恶性肿瘤等胃肠道其他疾病患者；②存在慢性感染、免疫功能障碍或其他可影响治疗观察指标的疾病患者；③存在心肺功能不全、肝肾功能障碍等内外科严重疾病患者。胃溃疡组男60例，女60例；年龄20～60岁，平均(35.6±8.7)岁。正常组男50例，女50例；年龄20～60岁，平均(35.2±8.1)岁。两组研究对象年龄、性别比较差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准，全部研究对象均签署知情同意书。

1.3 细胞和幽门螺杆菌培养 人胃黏膜上皮细胞GES-1购自中科院上海细胞库，采用含10% 胎牛血清和1%青链霉素的DMEM培养基培养，培养条件为37℃、5% CO2。全部细胞学实验传代次数小于10次。幽门螺杆菌(H.pylori)购自美国National Collection of Type Culture(国际标准株NCTC11637)。采用一次性涂布器将对数生长期的幽门螺杆菌液100 μL(2×107CFU/mL)均匀接种至弯曲杆菌琼脂基础培养基，于85% N2、10% CO2和5% O2的三气培养箱中培养48 h后，收集细菌置入无菌PBS中获取细菌悬液，采用麦氏比浊仪检测幽门螺杆菌菌液浓度。

1.4 胃黏膜损伤模型构建 分别以感染复数(MOI)1∶1、50∶1、100∶1、150∶1、200∶1、250∶1、300∶1的剂量培养GES-1细胞和幽门螺杆菌24 h。采用CCK-8检测细胞活性，计算IC50，作为幽门螺杆菌感染造模的MOI值[6]。

1.5 组织、血浆和细胞RNA提取 胃镜活检时夹取研究对象5 mm溃疡或正常组织2～3块。于胃镜检查前抽取肘静脉血2 mL，置EDTA抗凝管中，4℃ 1 200 g离心10 min，收集上清血浆。收集生长状态良好的GES-1细胞加入1 mL Trizol混匀。组织、血浆和细胞RNA提取均采用Trizol法[7]。

1.6 实时荧光定量PCR 采用逆转录试剂盒去除总RNA中残留的基因组DNA，反转录构建cDNA，反应体系20 μL，按照试剂盒说明书步骤进行。实时荧光定量PCR反应条件：50℃ 2 min，94℃ 10 min，(94℃ 15 s，60℃ 1 min)持续40个循环。引物均由北京博迈德生物技术有限公司设计合成，采用GAPDH mRNA 为内参。引物： MIAT: F: 5’-TTACTTTAACAGACCAGAA-3’, R’: 5’-CTCCTTTGTTGAATCCAT-3’；GAPDH: 5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，R:5’-GCAGGAGG CATTGCTGATGAT-3’。

1.7 细胞转染 MIAT过表达质粒(MIAT-OE)和MIAT-empty vector阴性对照空载体(MIAT-EV)由上海吉玛生物科技有限公司协助设计并合成。选取生长状态良好的GES-1细胞，胰酶消化并充分重悬细胞，以5×105接种至6孔板中。采用Lipofectamine 3000分别转染MIAT-OE和MIAT-EV至GES-1细胞，转染6 h后换液，继续培养48 h后提取RNA。采用实时荧光定量PCR检测MIAT的表达效果。

1.8 细胞活性 采用CCK-8试剂盒检测GES-1细胞活性。GES-1细胞以100 μL(3×103个细胞)接种于96孔培养板中，同时加入100 μL不含细胞的DMEM培养基作为空白对照组，每组4个重复孔。持续培养24、48、72、96和120 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37℃继续孵育3 h，采用酶标仪检测450 nm波长的吸光度值(A)，计算细胞存活率。细胞存活率(%) =(A转染-A空白)/(A对照-A空白)×100%。

1.9 细胞凋亡检测 分别向6孔培养板每孔中接入5×105个生长状态良好的正常GES-1细胞，生长至汇合度90%时采用不含EDTA的胰酶充分消化细胞，获取单细胞悬液，依次加入5 μL Annexin V-FITC+PI避光孵育15 min，1 h内采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.10 炎症因子水平检测 收集细胞培养上清液，12 000 g离心10 min后取上清液。采用IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA试剂盒检测，按照试剂盒说明书步骤进行。

1.11 统计学处理 全部实验重复3次，采用SPSS22.0统计软件。计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MIAT在幽门螺杆菌感染胃溃疡患者中的表达 胃溃疡组溃疡组织和血浆的MIAT的表达水平均低于正常组，差异有统计学意义(P<0.001)。120例胃溃疡患者中，76例为幽门螺杆菌阳性。幽门螺杆菌阳性的胃溃疡患者的溃疡组织和血浆中的MIAT表达水平均低于幽门螺杆菌阴性的胃溃疡患者，差异有统计学意义(P<0.001)。见图1。

***P<0.001。图1 MIAT在幽门螺杆菌感染胃溃疡患者中的表达Figure 1 The expression of MIAT in patients with gastric ulcer infected by Helicobacter pylori

2.2 幽门螺杆菌感染胃溃疡模型的构建 分别向GES-1细胞中加入不同MOI的幽门螺杆菌处理，培养24 h后，经CCK-8检测，发现随着MOI的升高，细胞增殖逐渐降低。据此计算IC50，MOI=116.32∶1，见图2a。以MOI=116.32∶1为幽门螺杆菌感染的MOI值，培养24 h，检测GES-1细胞中MIAT的表达。幽门螺杆菌感染后GES-1细胞的MIAT表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.001)，见图2b。

a: CCK-8检测幽门螺杆菌感染后GES-1细胞的增殖；b: 实时荧光定量PCR检测幽门螺杆菌感染后GES-1细胞的MIAT表达；***P<0.001, **P<0.01, * P<0.05。图2 幽门螺杆菌感染胃溃疡模型的构建Figure 2 Construction of Helicobacter pylori infection gastric ulcer model

2.3 过表达MIAT对幽门螺杆菌感染的GES-1细胞增殖的影响 MIAT过表达转染后的GES-1细胞的MIAT表达增加，差异有统计学意义(P<0.001)，见图3a。感染幽门螺杆菌72、96、120 h后，GES-1细胞增殖均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。转染MIAT后，HP感染的GES-1细胞的增殖均高于未转染MIAT的GES-1细胞和未转染MIAT的HP感染的GES-1细胞，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3b。

a: 实时荧光定量PCR检测GES-1细胞的MIAT表达；b: CCK-8检测GES-1细胞的增殖；* P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。图3 过表达MIAT对幽门螺杆菌感染的 GES-1细胞增殖的影响Figure 3 The effect of overexpression of MIAT on the proliferation of Helicobacter pylori-infected GES-1 cells

2.4 过表达MIAT对幽门螺杆菌感染的GES-1细胞凋亡的影响 感染幽门螺杆菌后，GES-1细胞的凋亡率升高，差异有统计学意义(P<0.05)。转染MIAT后，HP感染的GES-1细胞的凋亡率均低于未转染MIAT的GES-1细胞和未转染MIAT的HP感染的GES-1细胞，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图4。

***P<0.001。图4 过表达MIAT对幽门螺杆菌感染的 GES-1细胞凋亡的影响Figure 4 The effect of overexpression of MIAT on the apoptosis of GES-1 cells infected by Helicobacter pylori

2.5 炎症因子水平 感染幽门螺杆菌后，GES-1细胞的IL-1β、IL-6及TNF-α水平均增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。转染MIAT后，HP感染的GES-1细胞的IL-1β、IL-6及TNF-α水平均低于未转染MIAT的GES-1细胞和未转染MIAT的HP感染的GES-1细胞，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图5。

3 讨论

有研究[8]报道，MIAT在胃癌组织中存在异常的高表达现象，与患者的不良预后结局存在显著的相关性，进一步的机制研究发现MIAT通过调控miR-141/DDX5通路，可促进胃癌细胞的增殖、侵袭和转移，抑制凋亡，抵抗放化疗作用。MIAT 最早被发现于2000年，其染色体定位22q12.1，总长度30 051 bp。除胃癌外，已有研究[9-12]报道了MIAT在肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、白血病、淋巴瘤、胶质瘤等恶性肿瘤中均存在促癌作用。MIAT在乳腺癌、肾癌中均存在显著的高表达现象，与患者不良预后结局高度相关，显著缩短患者生存时间[13-14]。另有研究[15-17]发现，高糖环境可通过调控MIAT的表达增强血管平滑肌细胞活力，体外培养的过表达MIAT血管内皮细胞可参与TNF-α介导的炎症反应等。

***P<0.001。图5 过表达MIAT对GES-1细胞炎症因子的影响Figure 5 The effect of overexpression of MIAT on inflammatory factors in GES-1 cells

本研究结果显示，胃溃疡组溃疡组织和血浆的MIAT的表达水平均明显低于正常组，幽门螺杆菌阳性的胃溃疡患者的溃疡组织和血浆中的MIAT表达水平均明显低于幽门螺杆菌阴性的胃溃疡患者，提示MIAT低表达参与胃溃疡的发生、发展，且MIAT低表达与幽门螺杆菌的感染存在可能的相关性[18-20]。本研究结果同时显示，幽门螺杆菌感染后GES-1细胞的MIAT表达水平明显降低。

另外，本研究结果显示，与未转染MIAT的GES-1细胞和未转染MIAT的HP感染的GES-1细胞比较，转染MIAT后，HP感染的GES-1细胞的增殖明显增加，凋亡率和炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α水平均明显降低，提示胃黏膜细胞MIAT的表达下调可影响胃黏膜细胞的活性和稳定性，导致胃黏膜细胞凋亡和炎症反应；推测通过提高幽门螺杆菌感染的胃黏膜细胞的MIAT表达水平，可增强胃黏膜细胞的活性，维持其稳定性，控制炎症反应，实现胃黏膜的保护作用。

综上，长链非编码RNA MIAT在幽门螺杆菌感染的胃溃疡中存在低表达现象，MIAT的过表达可促进幽门螺杆菌感染后的胃黏膜上皮细胞增殖，降低凋亡率和炎症反应。