基于中药整合药理学平台的“半夏-柴胡”药对治疗胃炎的作用机制研究

杨彗敏，李敏慧，徐 男，门连汇，顾郁欣，王 悦，白 雪，罗汝婳，刘蒙蒙，田庆常，章洪华，王淑玲

(1.杭州师范大学 医学部，浙江 杭州 311121；2.山东省中医药研究院，山东 济南 250014)

胃炎归属于中医“胃脘痛” “痞满” “纳呆”等范畴。临床数据[1]表明，中医中药能使轻、中度的胃炎病理改变减轻，甚至逆转。小柴胡汤和半夏泻心汤出自东汉张仲景的《伤寒论》，均是调和肠胃、治痞之良方，方中柴胡有和解表里、疏肝升阳之功效，半夏降逆止呕，消痞散结。“半夏-柴胡”药对是该方关键组合，基本可体现全方之效用，起寒热并用、调其阴阳、疏肝和胃、消痞止痛之效，恰合慢性胃炎病证，对治疗胃炎有较好疗效[2]。

中药整合药理学平台(Traditional Chinese Medicine of Integrated Pharmacology，TCMIP，http://www.tcmip.cn/)是包含大量中药相关数据的数据库平台，主要从中药、中药单体成分、疾病和靶标4个层面对中药或复方的药理作用进行分析研究[3]。本研究通过中药整合药理学平台，采用中药整合药理学分析手段，对“半夏-柴胡”药对进行研究，分析中药有效成分与靶标的相互作用，探究其可能的作用通路，构建“半夏-柴胡”药对治疗胃炎的“中药(药对)-成分-靶标-通路”的分子机制网络，为相关处方的进一步开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 化学成分分析 依据《中国药典》(2015年版)，收集关于“半夏” “柴胡”的化学成分信息，包括中文名、英文名、分子式、相对分子质量、2D分子结构、3D分子结构等，并根据整合药理学平台TCMIP中的操作方法，将其导入中药整合药理学系统，建立“半夏” “柴胡”相关化学成分信息的数据库。

1.2 “半夏-柴胡”药对候选靶标提取 在中药整合药理学平台中，添加半夏、柴胡药材，并将疾病靶标关键词设为“gastritis(胃炎)”进行检索。在中药靶标预测界面，通过OpenBabel软件研究“半夏-柴胡”药对中的化学成分和分子指纹[3]，将药对中化学成分的二维结构与FDA已上市药物的结构进行化学指纹特征比对。将Jaccard系数大于0.8的药物靶标作为“半夏-柴胡”药对作用的候选靶标。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用 (protein-protein interaction, PPI)网络构建 利用整合药理学平台数据库，参照建立的“半夏-柴胡”药对作用的候选靶标信息数据库与 “gastritis” 疾病靶标之间的相互作用网络[4]，具体方法：卡值选用“节点连接度(degree)”的 2 倍中位数，节点选择中药靶标与相关疾病的基因相互作用网络的核心节点；在进一步的节点选择中，需要选取“节点连接度(degree)” “节点介度(betweenness)” “节点紧密度(closeness)”3个方面的中位数同时满足的节点。在节点选择结束后，将节点及所得到的靶标构建“半夏-柴胡”药对潜在靶标与治疗胃炎靶标之间相互作用的靶标网络。通过对通路富集分析处理转化，得到直观可视的“半夏-柴胡”药对抗胃炎作用机制的关联网络图谱。另外，整合药理学平台还运用其他数据库，例如Reactome、HAPPI、InAct等数据库，可以通过蛋白质-蛋白质相互作用信息(PPI)数据库，或者直接获得“半夏-柴胡”药对作用潜在靶标与胃炎疾病靶标之间的蛋白质相互作用的信息。

1.4 GO功能和通路分析 采用基因本体数据库(http：//www.geneontology.org/)进行基因GO功能分析，采用京都基因和基因组百科全书通路数据库(KEGG)(http：//www.genome.jp/kegg/)进行通路富集分析。

2 结果

2.1 “半夏-柴胡”药对中化学成分对应的预测靶标 经TCMIP分析，得到“半夏-柴胡”药对中103个活性成分，其中柴胡62个、半夏41个。半夏41个活性成分共对应237个靶标、柴胡62个活性成分共对应657个靶标。设定相似性分数≥0.8，筛选中药活性成分的预测靶标共291个，其中柴胡活性成分对应预测靶标95个，半夏活性成分对应预测靶标196个，两者共有靶标22个。

采用GO功能分析，对“半夏-柴胡”药对291个预测靶标基因进行分析，结果显示“半夏-柴胡”药对的分子功能主要涉及胞外谷氨酸门控离子通道活性(extracellular-glutamate-gated ion channel activity)、细胞溶质(cytosol)、离子型谷氨酸受体信号通路(ionotropic glutamate receptor signaling pathway)、蛋白质翻译的tRNA氨酰化(tRNA aminoacylation for protein translation)等。采用KEGG通路数据库对“半夏-柴胡” 预测靶标进行通路富集分析，结果显示，“半夏-柴胡” 药对主要涉及谷氨酸突触(glutamatergic synapse)、氨酰-tRNA生物合成(aminoacyl-tRNA biosynthesis)、神经系统(nervous system)、氨基酸代谢(amino acid metabolism)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(alanine, aspartate and glutamate metabolism)等通路。

2.2 “半夏-柴胡”药对治疗胃炎的候选靶标 利用TCMIP数据库中PPI相互作用分析平台，分析“半夏-柴胡”药对291个预测靶标与胃炎相关靶标之间的相互作用网络，共筛选出胃炎疾病靶标319个，与“半夏-柴胡”药对重叠的靶点有149个。选择degree前100名的候选靶标用cytoskaper软件绘制网络(图1)，degree的高度与节点的大小成正比，degree高度排前5位的分别为：腺苷酸环化酶1 (adenylate cyclase 1, ADCY 1)、腺苷酸环化酶2(adenylate cyclase 2, ADCY 2)、G蛋白偶联β1受体 (recombinant G protein beta 1, GNβ1)、腺苷酸环化酶5(adenylate cyclase 5, ADCY 5)、磷酸化蛋白激酶1 (phosphorylated protein kinase 1, p-Akt1) 受体，分别与70个、70个、62个、60个、60个疾病靶标有相互作用。

注：红色代表候选药物靶标。图1 “半夏-柴胡”药对治疗胃炎的候选靶标网络Figure 1 The candidate target network of Pinellia ternata-Bupleuri Radix for the treatment of gastritis

2.3 “半夏-柴胡”药对治疗胃炎的候选靶标基因功能 对149个“半夏-柴胡”药对治疗胃炎的候选靶标基因进行GO功能分析，分子功能主要涉及蛋白激酶活性(protein kinase activity)、蛋白质结合(protein binding)、GTP酶活性(GTPase activity)、信号转导(signal transduction)、焦点黏附(focal adhesion)、血小板活化(platelet activation)等(表1)。

表1 “半夏-柴胡”药对治疗胃炎的候选靶标基因功能信息Table 1 Functional information of candidate target genes for the treatment of gastritis by Pinellia ternata-Bupleuri Radix

表1(续)

2.4 “半夏-柴胡”药对治疗胃炎的候选靶标通路信息 采用KEGG数据库对149个“半夏-柴胡”药对治疗胃炎的候选靶标进行通路富集后，按照P值排序统计排位前20条的通路(表2)，主要涉及通路包括：趋化因子信号通路、神经系统、内分泌系统、雌激素信号通路、物质依赖、嘌呤代谢、乙型肝炎、核苷酸代谢等。

表2 “半夏-柴胡”药对治疗胃炎的候选靶标通路信息Table 2 Information on candidate target pathways of Pinellia ternata-Bupleuri Radix for the treatment of gastritis

2.5 “半夏-柴胡”药对治疗胃炎的多维网络关系 利用TCMIP数据库，采用cytoskaper 软件构建“半夏-柴胡”药对治疗胃炎的“中药-成分-靶标-通路”可视多维网络关系图，见图2。

注：绿色代表中药，紫色代表化学成分，蓝色代表靶标，橙色代表通路。图2 “半夏-柴胡”治疗胃炎的 “中药-成分-靶标-通路”多维网络关系图Figure 2 Multi-dimensional network relationship diagram of “Chinese medicine-components-targets-pathways” of Pinellia ternata-Bupleuri Radix in the treatment of gastritis

3 讨论

基于大数据，结合中药网络药理学分析，全面认识中医经方的药理作用是当前研究中药药理学机制的重要方法[5-7]。TCMIP 利用人工智能数据挖掘，结合当前网络及大数据，科学地构建了智能化和网络化的数据平台，可用于分析多种中药的活性单体成分与疾病相关的靶标及通路之间的联系，形成直观的网络图谱，揭示中药潜在的药效物质基础，探索药效作用的分子机制，为经方的研究提供了方法[8-9]。

目前对于胃炎的病因和发病机制还未完全阐明，主要包括幽门螺杆菌感染(引起的疣状胃炎更易发生腺体萎缩、肠化及异型增生)、胆汁反流(损伤胃黏膜)、血管活性因子及细胞因子改变(血管活性肠肽减少)、免疫因素(继发性自身免疫反应)、年龄因素(胃炎的发病率与年龄呈正相关)和其他因素(饮食、药物、肥胖等)。小柴胡加半夏泻心汤是经典名方，“半夏-柴胡”药对是该方的关键药材。研究[10]表明，半夏主要含生物碱类、有机酸类、甾醇类、挥发油类、氨基酸类、黄酮类等化学成分，其中半夏生物碱包括麻黄碱、腺苷、次黄嘌呤核苷、鸟苷等，具有抗炎作用，是治疗胃炎的主要药理活性成分。柴胡主要含挥发油、黄酮类、皂苷类、木脂素类、多糖类等。研究[11]表明，柴胡挥发油中石竹烯、榄香烯等成分及柴胡皂苷具有抗炎作用，为治疗胃炎的活性成分。本研究共筛选出“半夏-柴胡”药对活性成分103个，其中柴胡有62 个，半夏有41个。“半夏-柴胡”药对治疗胃炎的候选靶标基因有149个，其中ADC1、ADC2、和ADC5属于腺苷酸环化酶(AC)，能将细胞外刺激转化成细胞内信号，催化生成环腺苷-3’,5’-磷酸(cAMP)，通过调控cAMP引起胞内变化而产生生理反应。另外，“半夏-柴胡”药对的候选靶标GNβ1参与多种受体及信号转导过程，GNβ1受损可引起严重的神经性疾病。对“半夏-柴胡”药对治疗胃炎的候选靶标进行通路富集，主要涉及的信号通路有神经系统、内分泌系统、趋化因子和雌激素等。但TCMIP预测和提示的药物潜在靶点和通路还需要进一步的体内外实验验证。

综上所述，通过中药整合药理学平台的预测和分析，“半夏-柴胡”具有103个活性成分，可作用149个治疗胃炎的候选靶标，调节神经系统、内分泌系统、趋化因子途径等信号通路，发挥抗胃炎的作用。