Fas基因介导的细胞凋亡在帕金森病发病中的作用▲

夏 欢 高 华 王玉玲 罗 琴 杨新玲

(1 新疆医科大学附属肿瘤医院核医学科，乌鲁木齐市 830011，电子邮箱：xiahuanle3827@163.com；2 新疆医科大学第五附属医院神经内科，乌鲁木齐市 830011； 3 新疆医科大学第一附属医院内科VIP一病区，乌鲁木齐市 830054； 4 新疆医科大学附属肿瘤医院呼吸和神经内科，乌鲁木齐市 830011； 5 新疆医科大学第二附属医院神经内科，乌鲁木齐市 830063)

帕金森病是以黑质致密部多巴胺能神经元的变性、死亡为特征的神经变性疾病,临床上主要采用美多芭联合普拉克索治疗改善患者的症状[1]。Fas广泛表达于各种上皮细胞，内皮细胞，神经细胞及免疫细胞，而Fas配体属于1型膜蛋白，被称作“死亡受体”，通常只表达于激活的成熟CD4+、CD8+T细胞、B细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞表面[2]。既往研究提示Fas与配体结合可诱导表达Fas的细胞出现凋亡，这个过程与乳腺癌、阿尔兹海默病等多种疾病的发生有关[3-4]。Fas基因是否与帕金森病的发生和发展存在关联是近年来研究的热点[5]。本研究以帕金森病患者和帕金森病大鼠模型为研究对象，探讨Fas介导的细胞凋亡在帕金森病发病中的机制。

1 材料与方法

1.1 动物实验

1.1.1 实验动物：无特定病原体级雄性SD大鼠45只，购自新疆医科大学实验动物中心，体重(200±20)g，6～8周龄，实验动物在无特定病原体级动物实验室内饲养，温度为(23±2)℃，相对湿度为45%～80%。

1.1.2 实验分组与模型建立：将45只大鼠按随机数字法分为空白对照组、帕金森病组、Fas 小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)组，每组15只。空白对照组大鼠于左侧脑黑质内注入生理盐水3 μL；帕金森病组大鼠参考相关文献[6-7]进行定位及建立帕金森模型，用4%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉后，将其头部固定于脑立体定位仪上，将5 μg/μL 6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine hydrobromide，6-OHDA，美国Sigma公司，生产批号：162957)3 μL注射到大鼠于左内侧前脑束区。2周后于大鼠颈背部皮下注射阿扑吗啡(0.5 mg/kg)，诱发旋转运动，记录30 min的旋转次数，将旋转速度为7 r/min 以上的左旋鼠视为早期帕金森病大鼠模型建模成功；Fas siRNA组大鼠于左侧脑黑质内注入Fas siRNA(由武汉莱康生物有限公司设计合成) 3 μL(1.0 nmol/L)，2 d后同侧再注入同等计量6-OHDA，2周后检测相关指标。

1.1.3 免疫组化检测阳性多巴胺细胞数：干预2周后腹腔注射阿扑吗啡(0.5 mg/kg)后处死大鼠，取左侧中脑组织块行5 μm厚冠状连续冷冻切片，滴加正常山羊血清封闭液后，分别加入酪氨酸羟化酶一抗(美国Santa Cruz公司)，室温放置5 min后4℃冰箱过夜，滴加人辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(美国Santa Cruz公司)反应20 min，然后磷酸缓冲盐溶液洗3次，5 min/次，最后加入新配的二氨基联苯胺，于显微镜下显色，苏木素复染细胞核，封胶后显微镜下观察。

1.1.4 PCR检测细胞Fas mRNA表达量：处死大鼠后取出左侧中脑，加入2 mL TRIzol试剂提取总RNA。使用紫外分光光读法检测RNA浓度和纯度，确定RNA的A260/280在1.8～2.0之间，并稀释到300～500 ng/μL。按照MicroPoly(A)Pure试剂盒(美国Ambion公司，批号：4368814)使用说明进行反转录反应，以反转录得到的cDNA作为模板进行PCR扩增。20 μL反应体系包括2 μg RNA、1 μL OligodT(加水至11 μL，70℃水浴10 min后冰上冷却)，0.5 μL逆转录酶，0.5 μL RNA酶抑制剂，1～2 μL dNTP，补充buffer缓冲液至20 μL。以β-肌动蛋白作为管家基因。反应条件为94℃预变性5 min，94℃变性30 s，57.4℃条件下退火30 s，72℃延伸30 s，共进行30个循环，最后72℃延伸15 min。PCR的检测仪器为Bioanalyzer 2100(美国Agilent公司，型号：G2939A)。从GenBank中检索大鼠Fas全长cDNA序列(Gene ID 246097)，参考Song等[8]设计Fas 引物，Fas 引物正向序列为5′-GGAUUAUAUCAAGGAGGCCdTdT-3′，反向序列为5′-GGCCUCCUUGAUAUAAUCCdTdT-3′(武汉莱康生物科技有限公司合成)。β-肌动蛋白引物正向序列：5′-TCACCAACTGGGACGACAT-3′，反向序列：5′-GCACAGCCTGGATAGCAAC-3′。采用 2-ΔΔCt法计算各基因的相对表达量,△△Ct=△Ct(目的基因)-△Ct(β-肌动蛋白)，△△Ct= △Ct(实验样本)-△Ct(对照样本)。

1.2 临床研究 将2016年9月至2018年12月在新疆医科大学第二附属医院神经内科专家门诊就诊的153例帕金森病患者作为病例组，诊断均符合《中国帕金森病诊断标准(2016版)》[9]，排除脑血管疾病、脑炎、外伤、药物等所致的帕金森综合征以及帕金森叠加综合征、其他患有严重全身疾病的患者。其中男性91例、女性62例，年龄(63.14±8.45)岁。根据Hoehn-Yahr分级标准[10]，将有单侧肢体或双侧肢体症状，但无平衡障碍者作为轻度患者；有双侧肢体症状且存在平衡障碍，但保留独立能力作为中度患者；有严重肢体障碍无独立生活能力，但在无协助的情况下仍能行走或站立，或须在轮椅或床上，需人照料作为重度患者。再选取来自相同地区无帕金森病临床表现和帕金森病家族史的177例健康体检者作为对照组，其中男性109例、女性68例，年龄(61.35±9.50)岁。两组研究对象一般资料差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。抽取研究对象空腹静脉血2 mL至乙二胺四乙酸抗凝管中，采用酶联免疫检测试剂盒(美国Santa Cruz公司，批号：sc-8009)检测可溶性Fas(soluble Fas，sFas)和可溶性Fas配体(soluble Fas ligand，sFasL)水平，参考说明书进行操作。

表1 病例组与对照组一般资料的比较

1.3 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析,方差不齐时采用秩和检验；计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验；连续变量相关性采用Pearson检验，等级资料的相关性采用Spearman非参数相关分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠旋转行为发生情况 空白对照组大鼠未观察到旋转行为，帕金森病组和Fas siRNA组平均旋转圈数>7 r/min的大鼠分别为14和7只，Fas siRNA组大鼠旋转率较帕金森病组减少(χ2=5.714，P=0.005)。

2.2 3组大鼠阳性多巴胺细胞数和Fas mRNA表达情况 免疫组化结果显示，400倍视野下表达酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)阳性的多巴胺细胞表现为胞浆被染色呈现棕黄色或棕褐色，细胞形态也略显狭长，见图1。空白对照组、Fas siRNA组、帕金森病组TH阳性细胞计数依次减少(均P<0.05)，见表2。PCR结果显示，空白对照组、Fas siRNA组、帕金森病组的Fas mRNA表达水平依次升高(均P<0.05)，见表2。

图1 3组大鼠脑组织TH阳性细胞(400×)

表2 3组TH阳性细胞计数和FasmRNA相对表达水平的比较(x±s)

2.3 3组大鼠Fas mRNA表达水平与TH阳性细胞计数的相关性 相关性分析结果显示，帕金森病组与Fas siRNA组Fas mRNA表达水平与TH阳性细胞呈负相关性(r=-0.342，P=0.022；r=-0.514，P=0.003)，空白对照组Fas mRNA表达水平与TH阳性细胞数无相关性(r=0.066，P=0.354)。

2.4 不同病情程度患者与对照组sFas和sFasL水平的比较 153例帕金森病患者中，轻度21例，中度85例，重度47例。4组sFas和sFasL水平比较差异具有统计学意义，其中中度组和重度组sFas和sFasL水平均高于对照组和轻度组，且重度组以上指标水平均高于中度组(均P<0.05)，见表3。相关分析结果显示，帕金森病患者sFas和sFasL水平均与Hoehn-Yahr分级成正相关(r=0.822、0.723，均P<0.001)。

表3 不同病情程度患者与对照组外周血sFas和sFasL水平的比较(x±s，ng/L)

3 讨 论

帕金森病是中老年常见的神经系统变性疾病。其基本病理特征是Lewy小体的形成、黑质和纹状体内多巴胺能神经元的变性死亡，导致多巴胺递质减少，累积到一定程度后可导致帕金森病的发生，从而引起锥体外系运动功能障碍。免疫异常导致的黑质和纹状体区多巴胺能神经元凋亡、外周血淋巴细胞数量减少在帕金森病的发病机制中所起的作用，成为近年来研究的热点。而随着研究的不断深入，Blennow等[11]在帕金森病患者脑脊液中发现抗多巴胺神经元抗体，免疫异常导致的细胞凋亡学说在帕金森病的发病机制中所起的作用开始受到学者的重视[12]。随后的细胞、动物模型实验以及人体尸检都证明免疫异常导致的细胞凋亡参与了帕金森病的发生及进展[13]。死亡受体凋亡通路，主要由死亡受体介导并直接激活合半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-8，而Caspase-8是死亡受体凋亡通路中重要的启动者，起着中心调控作用，如果Caspase-8失活，即使细胞色素C发挥“扣动扳机”的作用也无法引起细胞凋亡的发生[14]。Fas是一种存在于细胞表面、分子量为48kD的跨膜蛋白分子,包含膜内区、跨膜区及膜外区三部分，其膜内存在由80个氨基酸序列组成的死亡域，该域是介导凋亡的功能区。Fas配体亦属于肿瘤坏死因子超家族，与死亡受体Fas结合后，就会引起Fas-Fas配体-Caspase-8反应，活化的Caspase-8进一步激活Caspase-3、7、9、10等，引起细胞凋亡的发生[15-16]。因此，理论上阻断外部凋亡通路可以阻止帕金森病的发生或延缓其进展。

本研究的动物实验结果显示，帕金森病组大鼠脑组织黑质Fas mRNA的表达水平高于空白对照组，提示Fas可能参与了帕金森的发病机制。而免疫组织化染色结果显示，Fas siRNA组、帕金森病组的TH阳性细胞计数较空白对照组减少，但Fas siRNA组TH阳性细胞计数多于帕金森病组，提示阻断Fas基因表达后，能够有效抑制多巴胺能神经元细胞的凋亡。且相关性分析显示，帕金森病组和Fas siRNA组Fas mRNA表达水平与TH阳性细胞数呈负相关性，即随着Fas基因表达的增加，TH阳性细胞呈下降趋势。提示Fas参与抑制多巴胺能神经元可能与Fas基因的表达有关。而Fas是Fas-Fas配体-Caspase-8凋亡途径中重要的启动因子，因此，进一步推测在帕金森病的发病机制中，Fas可能通过过度表达的方式促进多巴胺能神经元凋亡。Ferrer等[17]的研究结果显示帕金森病患者脑组织的反应性星形细胞中Fas/Fas配体表达升高。还有研究显示，在帕金森病小鼠模型中，Fas凋亡抑制分子2 (Fas-apoptotic inhibitory molecule 2，Faim2)对多巴胺能神经元具有保护作用，缺乏Faim2的卒中和细菌性脑膜炎的小鼠出现神经退行性变表现，而且Faim2缺陷型小鼠多巴胺能神经元减少53%[18]。这表明Fas诱导的凋亡是导致小鼠多巴胺能神经元死亡的重要病理机制。Jiang 等[19]发现丁苯酞对1-甲基-4苯基-吡啶离子诱导的帕金森病大鼠模型细胞凋亡具有一定抑制作用，其机制可能是通过调节死亡受体途径上Fas的表达，抑制细胞凋亡来实现的。

Fas广泛表达于各种上皮细胞、内皮细胞、神经细胞及免疫细胞中。尸检结果显示帕金森病患者脑内星形细胞Fas和Fas配体表达增高，sFas和sFasL分别作为Fas和Fas配体的活性功能分子，可溶于外周血中。sFas可与Fas竞争Fas配体，但并不引起凋亡，具有调节Fas的功能。而sFasL是膜相Fas配体经酶水解后的可溶性细胞因子，能够到达中枢神经系统发挥远端效应。这两种分子可能就是中枢与外周之间的“信使”，通过发挥信息的传递作用参与了帕金森病的发生与发展[20]。因此，检测外周血sFas和sFasL水平可以了解帕金森病的发生和发展情况。本研究的临床研究显示，帕金森病患者外周血sFas和sFasL水平均高于对照组，提示血sFas和sFasL可能参与帕金森病发生和发展的过程。相关分析结果显示，Hoehn-Yahr分级与帕金森病患者外周血sFas和sFasL水平呈正相关，提示帕金森病患者外周血sFas/sFasL不仅参与免疫异常，而且与疾病的严重程度有关。

帕金森病是一种神经变性疾病，与神经细胞凋亡有关，但细胞凋亡是一个复杂的过程，而多种因素可造成中脑黑质纹状体多巴胺神经元凋亡。帕金森大鼠Fas表达升高，Fas过表达介导的信号凋亡通路可能是帕金森病重要的发病机制之一；通过抑制Fas的表达从而抑制细胞凋亡，或可延缓帕金森病进程，从而达到有效治疗帕金森病的目的。