农林废弃物花生壳中总黄酮乙醇浸提工艺优化研究*

刘晓霞，赵业军，杨 洁，余 渤，程时劲

（武汉东湖学院 生物医用材料创新研究所 生命科学与化学学院，湖北 武汉 430212）

花生是产量丰富、食用广泛的一种坚果，在世界范围内都广泛种植，花生壳再利用用途广，可以用到各行各业，比如燃料、医药、化工、食用等多个方向。现代医学研究表明，花生壳的抗氧化效果很好，原因主要在于黄酮类物质的存在[1]。研究证明黄酮类化合物（代表物质木犀草素）不仅有抗菌消炎的作用，而且可以降低血压、血糖、血脂等，还存在使自身免疫力加强等功能[2-5]。黄酮类化合物无毒无害，尤其适合应用在医药和化妆品方面，其中在医药方面有治疗肿瘤的用药、消炎药、止疼药、降低血糖用药、胃药和护肝药等[6-8]；在护肤品方面主要应用这类化合物的延缓老化和预防氧化的功能而开发的高档护肤品类。本文对农林废物花生壳粉末中总黄酮的提取工艺进行了优化研究，通过改变提取溶剂的类别、浓度和料液比例、提取温度和时长，分别测定在这些不同条件下总黄酮的提取效率，得出了最佳优化工艺条件。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

农林废弃物花生壳、NaOH、甲醇、无水乙醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、NaNO2、Al（NO3）3、芦丁标准品（UV≥98%），以上试剂均为分析纯，均来自于国药集团化学试剂有限公司。

日本岛津AUY120型电子天平；101-2AB型电热鼓风干燥箱和FW135型中草药粉碎机，均为泰斯特仪器设备天津有限公司生产；UV-4802H型紫外可见分光仪（由上海尤尼柯仪器设备有限公司）。

1.2 试验方法

将准备好的花生壳用自来水洗涤和超纯水浸泡漂洗各3次，洗涤干净后将其放于40℃烘箱中烘至重量不再变化，干燥后的花生壳粉末样品用清洗干净的中草药粉碎机粉碎并过20目筛，将制备得到的粉末封存于密封袋中备用。

从密封袋中取备用的花生壳粉末，平行称取5份5.0g，分别转移至已编号的5个250mL烧杯中，往各个烧杯中分别加入30mL超纯水、丙酮、石油醚、70%甲醇、70%乙醇或乙酸乙酯。将所有烧杯浸入60℃恒温水浴箱中浸提2h，过滤并收集滤液后用体积分数为70%的乙醇溶液定容得粗提液，将粗提液稀释10倍得样品液，按照制备芦丁标准曲线的步骤配置待测溶液。另外需配制参比溶液，取一个250mL容量瓶，首先加入2mL 5%的NaNO2溶液，再依次10%Al（NO3）3溶液2mL和4%NaOH溶液20mL，用体积分数为70%的乙醇溶液将其定容，充分摇匀后放置15min待测试用。将待测样和参比样同置紫外可见分光光度计样品室，调节仪器波长测量吸光度数值，按照计算公式计算相应总黄酮的提取率。改变浸提溶剂浓度、原料溶剂配比、提取温度和提取时长后按照同样方式处理和测试。

2 结果与讨论

2.1 芦丁标准曲线的绘制

在120℃烘箱中将芦丁对照样品烘干并冷却。称量50mg芦丁对照品至烧杯中，用70%乙醇溶解，用70%乙醇溶液定容，即得稀释后的标准芦丁中间使用液，避光备用。准确吸取芦丁中间使用液0.00、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00mL分别置于已编号的6个50mL的容量瓶中，在各容量瓶中首先加入4mL体积分数为70%的乙醇溶液，再依次加入0.5mL质量分数为5%的NaNO2溶液，0.5mL质量分数10%Al（NO3）3溶液和4mL质量分数4%NaOH溶液，每加入一种试剂后均进行充分震荡并静置数分钟，最后用体积分数为70%的乙醇定容，得到芦丁系列标准溶液。设置紫外可见分光光度计仪器参数，将最大吸收波长调节至510nm，将系列标准溶液进行上机测试，记录吸光度数值，进行线性拟合并绘制拟合曲线，见图1。工作曲线回归方程为Y=0.00157+0.03615X，R2=0.99864，可见系列标液的吸光度数值和浓度之间拟合良好。

图1 芦丁标准曲线图Fig.1 Rutin standard curve

2.2 总黄酮提取率的计算

根据紫外可见光谱仪的测试结果和回归方程，计算出各样品溶液总黄酮的浓度，再由稀释倍数可以得到提取的总黄酮质量，与所取的花生壳粉末质量相比即可得出提取率。

式中 Q：提取率，%；m：花生壳粉末质量，g；C：总黄酮浓度，mg·mL-1；V：粗提液稀释后的体积，mL[9]。

2.3 提取溶剂及其浓度优化

在浸提温度为60℃，浸提时间为2h的条件下，选用不同溶剂将花生壳粉末在水浴锅中进行浸提，不同溶剂提取后根据测量结果和计算公式得到的提取率见图2。

图2 不同提取溶剂时提取率柱形图Fig.2 Extraction rate histogram for each solution

由图2可以看出，花生壳中总黄酮提取率高低依次为70%乙醇、70%甲醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、去离子水，但就安全性而言，乙醇相比甲醇更安全，所以选用70%乙醇溶液作为提取剂较为合适。

配置5份不同体积分数的乙醇，将花生壳粉末置于其中在60℃恒温水浴箱中浸提2h，经不同体积分数乙醇溶液提取后花生壳粉末中总黄酮的提取率见图3。

图3 乙醇体积分数对提取率的影响Fig.3 Effect of different ethanol concentration on extraction rate

由图3可见，乙醇体积分数从40%至70%，提取率不断增大，随后提取率则明显下降，表明总黄酮类化合物在溶剂中的溶解度一开始会随体积百分数的增加而增加，当乙醇溶液浓度超过70%时，高浓度的乙醇具有强烈的吸水作用影响了细胞的膨胀，使得提取效率随乙醇溶液体积分数的进一步增大而降低，所以最佳的乙醇提取体积分数为70%。

2.4 料液比的优化

选用几种不同料液比的70%乙醇溶液与花生壳粉末放入60℃的恒温水浴箱中浸提2h，花生壳粉末量与溶剂量的比例不同，提取效率也有明显差异，提取效率与料液比例的关系曲线见图4。

图4 花生壳粉末中总黄酮提取率随料液比的变化Fig.4 Influence of different ratio of material to liquid on extraction rate

由图4可知，花生壳粉末中总黄酮的提取效率在料液比小于1∶40时上升幅度明显，此后上升幅度趋于平缓。这是由于随着体系中溶剂量的增多，增大了原料表面与提取液间浓度差，使得整个体系中总黄酮的扩散变得更容易，最终增加了总黄酮的溶解率。但当提取剂超过一定量时，提取液中总黄酮的提取率不会受到原料表面与提取液间浓度差的影响。所以确定1∶40为最合适料液比。

2.5 提取温度的优化

设置不同的提取温度，在70%乙醇溶液与花生壳粉末放入60℃的恒温水浴箱中浸提2h将恒温水浴设置为不同的温度，在料液比1∶40，乙醇体积分数70%条件下，对花生壳粉末样品进行2h浸提。花生壳粉末中总黄酮提取效率与温度之间的关系见图5。

图5 花生壳粉末中总黄酮提取率随温度的变化Fig.5 Effect of different temperatures on the extraction rate

由图5可知，当温度从40℃升至65℃时，总黄酮提取率呈明显增加趋势，这主要得益于温度的上升导致了分子的运动速度不断加快，使得物质扩散和渗透的速度也加快，这有利于总黄酮类化合物更易于自由扩散到提取溶剂中。65～85℃，当温度过高时，总黄酮会被部分氧化破坏，使得提取率随温度的进一步增加而迅速下降，所以选择65℃为乙醇浸提法提取花生壳中总黄酮最佳提取温度。

2.6 提取时间的优化

选用70%的乙醇溶液，料液比为1∶40，在温度为65℃时浸提不同时长后花生壳样品中总黄酮的提取率见图6。

图6 花生壳粉末中总黄酮提取率随提取时长的变化Fig.6 Effect of different time on extraction rate

由图6可知，花生壳粉末中总黄酮的提取率先上升后明显下降，在提取时间超过3h后上升呈现拐点，可能原因有两点：（1）提取时间过长，乙醇溶液大量挥发；（2）在此温度下提取时间过长，黄酮类物质的稳定性变差。考虑到提取时间从2h再继续增大至3h会消耗更多时间成本，但提取效率增长甚微，故选择2h为最佳提取时间。

3 结论

本试验将农林废料花生壳低温烘干后用粉碎机充分研磨，以过筛后的花生壳粉末为原料，研究探讨了花生壳粉末中总黄酮提取的各种条件并进行了优化。通过改变提取溶剂的种类、采用不同体积分数的提取溶剂，改变原料与溶剂量的配比，在不同的提取温度和提取时长下分别测定和计算提取效率，最后总结了花生壳粉末中总黄酮提取的最佳工艺条件为：最合适提取溶剂为乙醇且乙醇体积分数为70%，料液比为1∶40，温度控制在65℃时最佳，提取时间2h。本实验方法简单易操作，实验反应易控制，实验中化学试剂不多，对环境几乎无污染，是一条绿色的工艺途径。