螺旋藻激酶对大鼠血管内皮损伤模型血浆血栓素A2、前列环素I2水平的影响

赵杰 王科 庞辉 李想 伍果 李宝嘉 龙贤 蒙浩

(广西医科大学基础医学院，广西 南宁 530021)

心脑血管疾病的发生主要是由于血凝和抗凝的平衡被打破，血管内血栓异常形成引起。传统的抗凝溶栓药比较昂贵，且毒副作用较大。近年来，来自海洋生物和微生物的第四代抗凝溶栓药物引起人们的关注，运用分子生物学技术把它们分离出来，开发新型高效、低毒、特异性高、副作用小的天然溶栓药物成为研究的热点，其代表药物有蚓激酶、葡激酶、水蛭素、纳豆激酶等。螺旋藻是一种原核生物，属于蓝藻门，蓝藻纲，颤藻科，具有宝贵的保健和药用价值。经筛选特殊菌种对它发酵后获得了一种含蛋白激酶(称为螺旋藻激酶，SPK)的产物，前期的实验研究证明SPK能使动物血液凝固时间延长，并有体内外的溶栓作用，还可使内皮细胞损伤模型组织型纤溶酶原激活物m-RNA的表达增加，抑制纤溶酶原激活物抑制物m-RNA的表达〔1～3〕。本文研究SPK对体内内皮损伤模型大鼠生理性血栓素(TX)A2、6-酮-前列腺(6-Keto-PG)F1a的影响，探讨其通过血小板功能影响血液凝固的机制，探讨其心血管保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 Wistar大鼠50只，雌雄不限，体重(200±200)g，清洁级，购买于广西医科大学实验动物中心，合格证号：SYXK桂2014-003号。饲养室温度控制在20～25℃。

1.2原料、药品、试剂与实验仪器 SPK自行提取、纯化，SPK发酵粉原料由广西北海市康福保健食品有限公司提供；FeCl3、乌拉坦，BBI公司；硫酸铵分析纯，上海生工生物工程有限公司；抗凝剂，上海沪峰生物科技有限公司。大鼠TXB2放射免疫试剂盒和6-keto-PGF1a放射免疫试剂盒，Cusabio生物科技公司。GradiFrac P-50型蛋白质层析系统，Pharmacia Biotech公司；8000-14000 MD25型透析袋，Solarbio公司；DFM-96型放射免疫γ计数器，合肥众成机电技术开发有限公司。

1.3SPK的提取与纯化 SPK发酵干粉用蒸馏水浸泡，充分混匀、搅拌，静置8 h后，低温离心收集上清液，然后进行硫酸铵分级盐析，45%硫酸铵盐析后收集上清、再加入硫酸铵使终浓度达75%后收集沉淀，经透析，冻干，凝胶过滤层析后得到SPK粉保存备用，纯化后的酶比活2 631.1 IU/mg，活力回收率42.3%，纯化倍数6.1倍〔4〕。

1.4实验动物分组及给药 大鼠随机分为五组，每组10只：正常对照组(2 ml生理盐水+40 μl生理盐水)、模型组(40 μl FeCl3+2 ml生理盐水+40 ml生理盐水)、SPK低剂量组 (40 μl FeCl3+2 ml 1 mg/100 g SPK)、SPK中剂量组(40 μl FeCl3+2 ml 10 mg/100 g SPK)、SPK高剂量组 (40 μl FeCl3+2 ml 20 mg/100 g SPK)。造模前8 h，正常对照组、模型组给予无菌生理盐水各2 ml，SPK低、中、高剂量分别股静脉按剂量给药一次。随后大鼠腹腔麻醉，分离右侧颈总动脉2～3 cm，正常对照组在颈动脉上方湿敷吸有40 μl生理盐水的滤纸，其他各组在相同位置湿敷吸有40 μl FeCl3溶液的滤纸。60 min后开腹从腹主动脉取血，按抗凝剂与血量的比例为1∶9来加入抗凝剂混匀，4℃ 3 000 r/min离心15 min，取血浆置-20℃冷冻保存待用〔4，5〕。

1.5放射免疫法检测TXB2、6-keto-PGF1a的含量 将TXB2试剂加入受检血浆中，TXB2和加入的125I-TXB2抗体产生竞争性免疫反应。TXB2含量与125I-TXB2与抗体结合量呈一定的函数关系，测定测量放射性强度来计算相应结合率，通过标准曲线可计算TXB2含量，以推断TXA2含量。将6-keto-PGF1a 试剂加入受检血浆中，6-Keto-PGF1a与试剂的125I-Keto-PGF1a抗体发生竞争性免疫反应。非标记I-6-Keto-PGF1a含量与125I-6-Keto-PGF1a与抗体复合物的比例呈反比。测定沉淀物的放射性计数，再通过标准曲线计算6-Keto-PGF1a含量。

1.6统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，方差齐使用LSD方法；方差不齐使用Games-Howell方法。

2 结 果

与正常对照组相比，模型组TXB2和6-Keto-PGF1a含量显著升高，TXB2/6-Keto-PGF1a比例显著升高(P<0.01)，SPK各剂量组与模型组对比，TXB2和6-Keto-PGF1a含量、TXB2/6-Keto-PGF1a比例显著下降。见表1。

表1 各组血液TXB2、6-Keto-PGF1a含量比较

3 讨 论

血栓是血液中凝血因子激活形成纤维蛋白的过程。在生理状态下，血液中有促凝和抗凝因素影响着凝血过程，血小板本身参与了凝血的过程，同时通过释放一些因子影响血凝、抗凝和纤溶过程。血管内皮细胞是血管内表面单层细胞屏障，具有抗凝和促凝双重特性，一方面可以将血液中凝血因子、血小板与内皮下胶原纤维隔离，防止内源性凝血反应的激活；另一方面通过合成能抑制血小板黏附聚集的前列环素(PG)来抑制凝血的过程〔6〕。血管内皮细胞损伤是血栓性疾病发生的启动因素，寻求有效的内皮细胞保护剂，抑制血小板活化来防治心脑血管疾病，已成为国内外抗血栓药物研究的热点之一。

TXA2和PGI2均为花生四烯酸的代谢产物，TXA2可以使血小板内游离Ca2+增多，cAMP减少，引起血小板释放内源性ADP，继而导致血管收缩和血小板聚集。TXA2性质极不稳定，但其代谢产物TXB2相当稳定。 PGI2与TXA2的作用正好相反，它具有强烈的舒张血管和抑制血小板聚集的作用。PGI2半衰期也很短，很快转化成稳定的6-Keto-PGF1a。正常生理状态下，血浆或组织里的PGI2和TXA2浓度处于相对平衡状态，保持血管通畅并维持适当的紧张性。当血管损伤时，血小板和内皮下胶原纤维接触，促使TXA2生成增多而促进血小板聚集，而血管壁则通过促进花生四烯酸合成PGI2来对抗TXA2的作用以达到动态平衡。如果TXA2与PGI2的平衡被打破则引起血栓形成〔4～6〕。

本实验结果提示TXA2和PGI2系统紊乱，促进了血栓的形成。SPK明显改善了TXA2分泌，从而影响TXA2/PGI2比值来增加抗凝活性。因此，SPK可以保护受损伤刺激的血管内皮细胞和血小板，发挥抗血栓形成和保护心血管系统的作用。