Linc00152靶向miR-103a-3p对膀胱癌细胞放射敏感性和增殖、凋亡的影响

李建伟 田文静 刘民

(1沧州市中心医院泌尿外二科，河北 沧州 061001；2沧州医学高等专科学校)

膀胱癌属于泌尿系统常见恶性肿瘤之一，其主要生物学特性为侵袭性强、易转移及复发等，但胰腺癌发病机制尚未完全阐明〔1〕。长链非编码RNA(LncRNA)可通过调控基因转录或转录后水平进而参与肿瘤发生及发展过程，研究表明长链非编码RNA Linc00152(LncRNA Linc00152)在恶性肿瘤中高表达，并可在肿瘤发生及发展过程中发挥促癌作用〔2〕。Linc00152可通过调控肿瘤细胞增殖、凋亡等生物行为进而促进肿瘤发生及发展〔3〕。研究报道指出Linc00152过表达可促进肝癌、血管瘤细胞的增殖、迁移〔4～6〕。但Linc00152对膀胱癌生物行为及放射敏感性的影响尚未见报道。研究表明微小RNA-103a-3p(miR-103a-3p)在膀胱癌组织中的表达显著降低，同时TCF25可通过miR-103a-3p/miR-107调控CDK6的表达进而促进膀胱癌的增殖迁移〔7〕。通过对Linc00152下游靶基因进行预测发现miR-103a-3p可能为Linc00152作用靶点，但Linc00152是否通过调控miR-103a-3p表达进而参与膀胱癌细胞增殖、凋亡过程及其对细胞放射敏感性的关系尚未可知。因此，本研究通过观察Linc00152表达变化对膀胱癌细胞增殖、凋亡及放射敏感性的影响，并探讨其是否通过调控miR-103a-3p表达而发挥作用，为深入研究膀胱癌发病机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1一般资料 选取2016年3～12月沧州市中心医院收治的膀胱癌患者41例为研究对象，所有患者进行手术且经病理证实为膀胱癌，男21例，女20例，年龄55～70〔平均(65.32±6.58)〕岁，本研究经医院伦理委员会批准，患者知情且签署同意书。于术中切除膀胱癌组织及癌旁组织标本(>5 cm)，放入液氮中保存，术后转移至-80℃超低温冰箱保存。

1.2实验细胞与主要试剂 膀胱癌BIU-87细胞购自美国ATCC细胞库。RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；Trizol试剂与Lipofectamine2000转染试剂均购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒与实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司；siRNA、miR-103a-3p mimcs、miR-103a-3p抑制剂(anti-miR-103a-3p)及其各自阴性对照均购自上海吉玛生物科技有限公司；WT-Linc00152、MUT-Linc00152载体均购自上海吉玛制药有限公司；CyclinD1、Bcl-2、P21、Bax抗体均购自美国CST公司；双荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司；噻唑蓝(MTT)检测试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；Annexin V-FITC双染细胞凋亡试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3方法

1.3.1细胞转染与处理 膀胱癌BIU-87细胞放入含有10%胎牛血清及青霉素-链霉素混合溶液的RPMI1640培养基内培养，用0.25%胰蛋白酶进行传代，取对数生长期膀胱癌BIU-87细胞，胰蛋白酶消化细胞，调整细胞密度，以每孔5×105个细胞的密度接种于6孔板，放入细胞培养箱内继续培养，细胞生长融合度达到50%～80%时进行转染，实验将膀胱癌BIU-87细胞分为si-NC组(转染Linc00152的阴性对照)、si-Linc00152组(转染Linc00152-siRNA)、miR-NC(转染miR-103a-3p阴性对照)组、miR-103a-3p(转染miR-103a-3p mimics)组、si-Linc00152+anti-miR-NC组(共转染Linc00152-siRNA与anti-miR-NC)、si-Linc00152+anti-miR-103a-3p组(共转染Linc00152-siRNA与anti-miR-103a-3p)，转染48 h后采用qRT-PCR检测膀胱癌BIU-87细胞中Linc00152与miR-103a-3p的表达水平鉴定转染效果。

1.3.2qRT-PCR检测Linc00152、miR-103a-3p表达 分别取各组膀胱癌BIU-87细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA，应用NanoDrop检测RNA浓度，参照反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，按照qRT-PCR试剂盒说明书进行qRT-PCR，反应体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)12.5 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各1 μl，ddH2O补足体系至20 μl。反应条件：95℃预变性5 min循环1次，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循环40次。Linc00152以GAPDH为内参，miR-103a-3p以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算Linc00152、miR-103a-3p相对表达量。

1.3.3MTT检测细胞增殖 收集对数生长期膀胱癌BIU-87细胞，以每孔2×103个细胞的密度接种于96孔板，在接种后24 h、48 h、72 h分别加入MTT溶液(20 μl/孔)，培养4 h后，每孔分别加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡混匀，利用酶标仪检测波长为490 nm处各孔吸光度(OD)值。

1.3.4检测细胞凋亡率 预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤膀胱癌BIU-87细胞，加入100 μl 1×结合缓冲液重悬细胞，取5×105个细胞转移至离心管，PBS洗涤，加入5 μl Annexin V-FITC，避光孵育15 min，1 000 r/min转速离心3 min，离心半径6 cm，加入5 μl PI，避光孵育15 min，加入400 μl 1×结合缓冲液，充分混匀，置于流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3.5Western印迹检测CyclinD1、Bcl-2 P21、Bax蛋白表达 取对数生长期膀胱癌BIU-87细胞，加入RIPA蛋白裂解液裂解细胞，蛋白变性后，取30 μg蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，反应结束后转膜、封闭，加入CyclinD1、Bcl-2 P21、Bax一抗(稀释比1∶200)，4℃孵育24 h，加入二抗(稀释比1∶1 000)，放入恒温培养箱内继续培养4 h，PBST洗涤，滴加ECL发光试剂，放入凝胶成像仪并应用Quantity One软件分析蛋白灰度值。

1.3.6克隆形成实验 收取生长良好的膀胱癌BIU-87细胞，用0、2、4、6、8 Gy不同照射剂量照射细胞，放入恒温培养箱继续培养10～14 d，PBS洗涤3次×10 min，使用甲醇固定20 min，吉姆萨染色40 min，洗涤后置于显微镜下观察形成的集落数，计算细胞存活分数与放射增敏比。

1.3.7双荧光素酶报告基因实验 生物信息学数据库预测发现Linc00152与miR-103a-3p存在靶向结合位点，分别构建含有结合位点序列的野生型WT-Linc00152报告基因载体，将Linc00152与miR-103a-3p结合位点突变序列构建到报告基因载体记为MUT-Linc00152，同时将膀胱癌BIU-87细胞接种于24孔板，待细胞生长融合度达50%～80%时分别将miR-103a-3p mimic或miR-NC与WT-Linc00152、MUT-Linc00152共转染BIU-87细胞，根据荧光素酶检测试剂盒说明书进行操作，继续培养24 h，收集各组细胞并检测各细胞相对荧光素酶活性。

1.4统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1Linc00152在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达 与癌旁组织(0.25±0.02)相比，膀胱癌组织(0.93±0.09)中Linc00152的表达水平显著升高(t=47.227,P=0.000)。

2.2抑制Linc00152对细胞BIU-87增殖、凋亡的影响 相较于si-NC组，si-Linc00152组膀胱癌 BIU-87细胞中Linc00152的表达水平显著降低(P<0.05)，提示转染效果良好。与si-NC组相比，si-Linc00152组膀胱癌 BIU-87细胞增殖活性明显降低(P<0.05)，而细胞凋亡率显著增加(P<0.05)，Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达量均显著降低(P<0.05)，而P21、Bax蛋白表达量均显著升高(P<0.05)。见图1，图2，表1。表明抑制Linc00152表达可能通过调控细胞增殖及凋亡相关蛋白表达而抑制膀胱癌细胞增殖并促进细胞凋亡。

图1 抑制Linc00152对细胞BIU-87凋亡的影响

图2 抑制Linc00152对细胞BIU-87增殖、凋亡蛋白表达的影响

表1 抑制Linc00152对细胞BIU-87增殖和凋亡的影响

2.3抑制Linc00152表达联合放射对细胞BIU-87存活率的影响 用不同照射剂量照射膀胱癌细胞后，si-Linc00152组膀胱癌细胞存活率与si-NC组比较显著下降(P<0.05)，增敏比(SER)为1.879，见表2、表3。表明抑制Linc00152表达可明显增强膀胱癌细胞放射敏感性。

表2 抑制Linc00152对细胞BIU-87存活分数的影响

表3 单击多靶模型参数

2.4Linc00152靶向、调控miR-103a-3p 靶基因预测结果显示Linc00152的3′UTR中含有与miR-103a-3p互补的核苷酸序列，见图3。双荧光素酶报告实验检测结果显示，与转染miR-NC组比较，共转染WT-Linc00152与miR-103a-3p mimics后可显著降低膀胱癌细胞的荧光素酶活性(P<0.05)；而共转染MUT-Linc00152与miR-103a-3p mimics后膀胱癌细胞的荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)，见表4。qRT-PCR实验进一步检测结果显示，与pcDNA3.1组(0.22±0.02)相比，pcDNA3.1-Linc00152组(0.09±0.01)膀胱癌细胞中miR-103a-3p的表达水平显著降低(P<0.05)；与si-NC组(0.23±0.02)相比，si-Linc00152组(0.67±0.06)膀胱癌细胞中miR-103a-3p的表达水平显著升高(P<0.05)。

表4 双荧光素酶报告实验

图3 Linc00152靶向miR-103a-3p

2.5过表达miR-103a-3p对细胞BIU-87增殖、凋

亡及放射敏感性的影响 与miR-NC组相比，miR-103a-3p组膀胱癌细胞中miR-103a-3p的表达水平显著升高(P<0.05)。提示转染效果良好。相对于miR-NC组，miR-103a-3p组膀胱癌细胞增殖活性及细胞存活分数均显著降低(P<0.05)，而细胞凋亡率显著增加(P<0.05)，Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.05)，而P21、Bax白表达量显著增加(P<0.05)，见图4、表5～表7。

表7 单击多靶模型参数

图4 过表达miR-103a-3p对细胞BIU-87增殖、凋亡蛋白表达的影响

表5 过表达miR-103a-3p对细胞BIU-87增殖及凋亡的影响

表6 miR-103a-3p对细胞BIU-87存活分数的影响

2.6抑制细胞miR-103a-3p表达能逆转抑制Linc00152对细胞BIU-87增殖、凋亡及放射敏感性的影响 si-Linc00152+anti-miR-103a-3p组膀胱癌细胞存活分数较si-Linc00152+anti-miR-NC组显著增加(P<0.05)，细胞活性与细胞存活分数均明显升高(P<0.05)，而细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，增敏比(SER)明显降低，CyclinD1、Bcl-2蛋白表达量明显升高(P<0.05)，而P21、Bax蛋白表达量明显降低

(P<0.05)，见图5、表8～10。

1～2：si-Linc00152+anti-miR-NC组，si-Linc00152+anti-miR-103a-3p组图5 抑制细胞miR-103a-3p表达能逆转抑制Linc00152对细胞BIU-87增殖、凋亡蛋白表达的影响

表8 抑制 miR-103a-3p对抑制Linc00152处理的细胞BIU-87存活分数的影响

表9 抑制细胞miR-103a-3p表达能逆转抑制Linc00152对细胞BIU-87增殖及凋亡的影响

表10 单击多靶模型参数

3 讨 论

随着膀胱癌致病机制研究的不断深入，研究发现寻找高度可靠性的生物标志物对膀胱癌诊断及治疗均具有重要意义，部分LncRNA可作为多种恶性肿瘤诊断及治疗的重要标志物〔8〕。目前临床采用放射、手术及化疗等方式治疗膀胱癌，但部分患者对放射治疗具有一定抵抗性导致患者5年生存率较低〔9〕。因而深入探讨膀胱癌发病机制对增强放射敏感性具有一定现实意义。LncRNA常通过诱导细胞DNA损伤、沉默miRNA、或调控细胞迁移及侵袭等过程参与肿瘤发生及发展过程〔10〕。因此，本研究寻找新型LncRNA分子并分析其与miRNA在膀胱癌发生及发展过程中的调控网络，为提高治疗效果及治疗方案的制定提供指导依据。

Linc00152在胃癌细胞系中的表达水平明显升高，通过下调Linc00152表达可明显降低胃癌细胞增殖速度并诱导细胞凋亡，同时可降低细胞迁移及侵袭能力，进一步研究〔11，12〕表明Linc00152可通过调控miR-17-5p表达而促进胃癌细胞增殖及迁移。Yang等〔13〕研究发现Linc00152在食管鳞癌细胞中呈高表达，并可促进细胞增殖及迁移。Li等〔14〕研究表明Linc00152可通过调控miR-139-5p表达进而促进口腔鳞状细胞癌增殖及侵袭。研究〔15，16〕表明P21可抑制CyclinD1与CDK复合物活性而诱导细胞周期停滞于G1期进而抑制细胞生长，细胞凋亡对细胞存活及稳态至关重要，Bcl-2与Bax是调控细胞凋亡的关键因子，Bcl-2属于凋亡抑制因子，而Bax是凋亡促进因子。说明抑制Linc00152表达可能通过下调CyclinD1、Bcl-2及上调P21、Bax表达进而抑制膀胱癌细胞增殖并诱导其凋亡。提示抑制Linc00152表达可抑制膀胱癌细胞增殖及促进其凋亡，增强细胞放射敏感性。

miR-103a-3p在肝癌、肺癌中等低表达并可发挥抑癌基因作用，研究〔17，18〕表明miR-103a-3p过表达可能通过靶向调控FEZF1/CDC25A表达进而抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡。miR-103a-3p在卵巢癌、结肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤组织及细胞系中均呈低表达，并可能作为患者预后的独立预测因子，研究〔19,20〕表明miR-103a-3p可通过靶向调控PDK4表达而减弱乳腺癌细胞糖酵解活动进而抑制细胞增殖。本研究通过靶基因预测显示miR-103a-3p可能是Linc00152的靶基因，采用双荧光素酶报告实验证实Linc00152可作为miR-103a-3p竞争性吸附cRNA分子，并负向调控miR-103a-3p表达，进一步研究发现miR-103a-3p过表达可明显抑制膀胱癌细胞增殖并诱导其凋亡，并可增强细胞放射敏感性，提示miR-103a-3p过表达可通过调控膀胱癌细胞增殖及凋亡过程进而参与膀胱癌发生及发展过程。

综上所述，Linc00152在膀胱癌中呈高表达，抑制其表达后可通过调控miR-103a-3p表达进而影响膀胱癌细胞增殖、凋亡及其放射敏感性，可为膀胱癌诊断及治疗提供新方向。但关于Linc00152在体内实验及其在临床诊断中的应用仍需深入研究。